Alkali Proteinase Assay Kit (Spectrophotometry)

在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在 680nm 有特征吸收峰，测定 680nm 吸光度增加速率，来计算 AKP 活性。

50T/24S规格的产品组成如下：

一、自备用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、离心机、研钵、1.5 mL EP 管、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
二、试剂预配制：
CB0018S-B：临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解备用。
CB0018S-C：临用前加入 10mL CB0018S-A沸水浴中溶解。
CB0018S-D：临用前加入 50mL 蒸馏水充分溶解备用。
三、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0018S-A体积(mL)为 1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0018S-A）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
2.血清或培养液：直接测定。
3.细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：CB0018S-A体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL CB0018S-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
四、检测步骤：
1.分光光度计预热 30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。
2.CB0018S-B、C、D置于 40℃水浴中保温30min。
3.按顺序加入下列试剂：

2. 空白管和标准管只需要测定1-2次。

五、计算公式：
1.按照样本蛋白浓度计算：
AKP 活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性 (U/mg prot) = C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
注： C标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：(100+200+200)÷200 = 2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入 1mL 蒸馏水匀浆提取离心后，用TargetMol蛋白质含量测定试剂盒(C0050)测定；V1：加入反应体系中粗酶液（血清或培养液）体积，100μL=0.1 mL；T：催化反应时间，10min。
2.按照样本质量计算：
AKP 活性单位定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生 1μmol酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性 (U/g) = C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
注： C标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：(100+200+200)÷200=2.5；W：样品质量，g；V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积，1mL； T：催化反应时间，10min。
3.按照液体体积计算：
AKP 活性单位定义：40℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性 (U/mL) = C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷V1÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
注： C标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：(100+200+200)÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1 mL；T：催化反应时间，10min。
4.按照细胞数量计算：
AKP 活性单位定义：40℃每10⁴个细胞每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
AKP 活性 (U/10⁴ cell) = C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量
注： C标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：(100+200+200)÷200=2.5；V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。

1.临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。
2.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。