ACO Assay Kit (UV Spectrophotometry)

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。

50T/48S规格的产品组成如下：

一、自备用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL CB0014UV-A和10μL CB0014UV-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆转入离心管内600g，4℃离心5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4.上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5.在步骤4的沉淀中加入200μL CB0014UV-B和2μL CB0014UV-C，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.样本测定：
（1）将工作液，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。
（2）在1mL石英比色皿中加入100μL样本900μL工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min 20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
四、ACO酶活性计算：
1.按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T = 536×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 108×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性 (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.722×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。