α-Ketoglutarate Dehydrogenase Assay Kit (UV Spectrophotometry)

Name: α-Ketoglutarate Dehydrogenase Assay Kit (UV Spectrophotometry)
Brand: TargetMol
SKU: CB0188UV
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0188UV

别名 α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

α-酮戊二酸脱氢酶（Alpha ketoglutarate dehydrogenase; α-KGDH; AKGDH; EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环的关键酶，催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。α-KGDH对于三羧酸循环的进行，能量代谢的稳定，神经递质的代谢等诸多生理及病理过程极为重要。

规格	价格	库存	数量
50 T	¥ 1,056	4-6日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD⁺ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示 α-KGDH 活性。

产品规格

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0188UV-A	60mL×1 瓶	4℃保存；
CB0188UV-B	0.6mL×1 瓶	易挥发试剂，用完后尽快密封；-20℃保存；
CB0188UV-C	60 mL×1 瓶	4℃保存；
CB0188UV-D	1.2 mL×1 支	4℃保存；
CB0188UV-E	粉剂×2 支	4℃保存；临用前取1支CB0188UV-E，加入1 mL CB0188UV-C，充分溶解，4℃可保存4周；
CB0188UV-F	粉剂×2 支	-20℃保存；提供一个 5 mL 试剂瓶，临用前取 1 支CB0188UV-F，加入 3 mL CB0188UV-C，充分溶解，用不完的试剂-20℃ 分装保存 4 周，避免反复冻融；
CB0188UV-G	粉剂×2 支	-20℃保存；临用前取 1 支CB0188UV-G加入 1.5 mL CB0188UV-C充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
CB0188UV-H	粉剂×2 支	-20℃保存；临用前取 1 支CB0188UV-H，加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
工作液配制	临用前依次取 22 mL CB0188UV-C、0.5 mL CB0188UV-D、1 mL CB0188UV-E、2.75 mL CB0188UV-F、1.25 mL CB0188UV-G（共 27.5mL，约 27T），充分混合待用，现用现配。

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL CB0188UV-A和 10μL CB0188UV-B，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.然后11000g，4℃离心 10min,取上清。
3.上清液即胞浆提取物，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。
2.空白管：取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后，再依次加入40μL CB0188UV-H和60μL蒸馏水，立即开始计时 10s，混匀并立即测量340nm处10s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min10s时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。空白管只需测1-2次。
3.测定管：取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后，再依次加入40μL CB0188UV-H和60μL样本，立即开始计时10s，混匀并立即测量340nm处10s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min10s时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。

四、α-KGDH 活力单位的计算：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109 ]÷(Cpr×V样) ÷T =1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
2.按样本质量计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性(U/g 质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109 ]÷(V样÷V样总×W)÷T =1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3.按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性(U/104 cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109 ]÷(V样÷V样总×500) ÷T =2.977×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应体系总体积，1.1×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.06mL；V样总：加入CB0188UV-A和CB0188UV-B体积，1.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项

1.测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。