RBM1-151 (20 μM，1 小时) 在以 A375/AC 细胞裂解液为基础的无细胞系统中，仅通过酸性神经酰胺酶水解生成 RBM1-151-NH2。RBM1-151 (0-20 μM，30 分钟) 在酸性缓冲液中由 A375/AC 细胞裂解液 (20 μg) 水解，动力学参数的 Michaelis-Menten 分析显示 app Km = 7.0 μM 和 app Vmax = 99.3 nM/min。RBM1-151 (5 μM，3 小时) 在过表达 NAAA 的 HEK293/NAAA 细胞裂解液 (10 μg) 中表现出高于 HEK293/mock 裂解液的水解水平（通过荧光产物）。在 Farber 病 (FD) 细胞 (缺乏 AC) 中，RBM1-151 (20 μM，3 小时) 产生的荧光很少，而在 FD/AC 细胞 (过表达 AC) 中，荧光显著增加（在完整细胞中观察）。RBM1-151 (20 μM，3 小时) 在 A375/AC 细胞 (过表达 AC) 中比 A375/WT 细胞显示更高的水解程度。实验方法指南（以下为推荐实验方案，可根据需要调整）：1. 细胞准备 1.1 悬浮细胞 (如 AML 细胞系：MM-6、HL-60)：在 RPMI-1640 培养基中添加 20% FBS 培养；分盘前调整密度至每孔 2 × 10^4 个细胞。1.2 贴壁细胞 (如黑色素瘤细胞系：A375/AC、C8161；HEK293)：在含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养；在 96 孔板中每孔接种 2 × 10^4 个细胞，过夜孵育确保贴壁。注意：实验前从培养基中移除抗生素，以避免干扰。2. RBM1-151 孵育与信号检测 2.1 每孔加入 50 μL 20 μM RBM1-151 工作溶液（配于含 20% FBS 的培养基，最终 RBM1-151 浓度为 20 μM）。2.2 在 37°C 和 5% CO2 下孵育 1 小时。2.3 加入 25 μL 100% 甲醇终止反应。2.4 立即加入 100 μL NaIO4 溶液 (2.5 mg/mL，配于 100 mM 甘氨酸-NaOH 缓冲液，pH 10.6)。2.5 在 37°C 和 5% CO2 条件下避光孵育 30 分钟。2.6 使用微量滴定板读数仪测量荧光信号；扣除仅含培养基和 RBM1-151 无细胞孔的背景信号。