常见问题解答问细胞实验中需要加多少抑制剂?
答通常建议您参考同模型实验发表的文献报道;除参考文献报道以外,还需要通过预实验做“剂量-效应曲线”确定最佳作用浓度(浓度梯度);通过“时间-效应曲线”确定最佳孵育时间(处理时间梯度)。另外,抑制剂的使用量受多种因素影响,包括抑制对象的可接触性、细胞通透性、孵育时间、细胞种类等等。我们建议通过检索文献确定使用抑制剂的起始浓度。
如果有报道的 Ki 值或 IC50 值,可以采用其 5-10 倍的量开始尝试以达到抑制酶活性的最佳效果。
如果抑制剂的 Ki 值或 IC50 值未知,则需要在更广泛的范围尝试抑制剂的使用浓度,并采用 Michaelis-Menten 动力学计算 Ki 值。
一般设立溶解抑制剂时所采用的溶剂作为对照,以排除溶剂的非特异性影响。
问抑制剂母液的储存方式?
答母液配置完成后,一般储存于 -80℃,可以存 1 年以上。建议多分装几管,避免反复冻融,常用的存于 4 度,可放一周以上。
问加药后检测结果没有作用,是不是产品质量有问题?
答产品质量没有问题,都是经过两次严格质检的,HNMR确定产品结构,HPLC确定化合物纯度。同一个抑制剂由于实验材料(细胞、动物)的不同,IC50 和实验效果也是不一样的,不能照搬文献报道的方法,应该根据自己的实验设立浓度梯度,得到一个最适合的浓度。
问细胞实验中,抑制剂如何溶解?
答用 DMSO 配置较高浓度母液,母液存于 -80℃,建议多分装几管,一周内使用的存于 4℃,避免反复冻融。实验时用 pbs、生理盐水、培养基、水这些稀释,细胞实验DMSO的终浓度不超过 0.1%。如果超过 0.1%,则需要在做预试验的时候,先进行溶剂阴性对照实验,排除溶剂对细胞的影响。
问Tween-20 可以用 Tween-80 替代吗?
答不建议使用 Tween-20。相较于 Tween-20,Tween-80 的耐受性更好,Tween-80已被用作评估实验药物和毒物的行为影响的工具,且没有明显的副作用。
参考文献:Castro CA, Hogan JB, Benson KA, Shehata CW, Landauer MR. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 1995 Apr;50(4):521-6.
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