HPK1-IN-69 (compound 53) 在 Jurkat T 细胞中可剂量依赖性抑制 CD3/CD28 诱导的 SLP76 磷酸化，pSLP76 的 IC 50 为 23.1 nM (0-300 nM; 2 h pre-incubation)；同时可剂量依赖性增强 Jurkat T 细胞 (EC 50 = 29.9 nM) 和 hPBMC 中 CD3/CD28 诱导的 IL-2 释放，并可逆转 PGE 2 介导的 IL-2 抑制作用 (0-1000 nM; 1 h pre-incubation)。此外，HPK1-IN-69 在小鼠和人肝微粒体中显示良好的代谢稳定性，半衰期均超过 30 min (0-60 min)；对人 CYP 同工酶呈弱抑制作用，IC 50 为 6.1 μM 至 >50 μM，并且对 hERG 通道抑制较弱，IC 50 为 7.92 μM，提示其具有较低的 CYP 相互作用风险和心脏毒性风险。

HPK1-IN-69（15-30 mg/kg；腹腔注射；每日 2 次；连续 17 天）在 CT26 结直肠癌小鼠模型中表现出剂量依赖性抗肿瘤活性。HPK1-IN-69（15-60 mg/kg；腹腔注射/口服；每日 2 次；连续 21 天）在 MC38 结直肠癌小鼠模型中显示出显著抗肿瘤活性；60 mg/kg 口服时肿瘤生长抑制率（TGI）达 64%，与抗 PD-1 抗体联用时呈协同作用，TGI 可提高至 77%。