CY7.5-NHS ester 标记步骤：一、蛋白制备：为了达到最佳标记效果，应将蛋白（抗体）浓度调整至 2 mg/mL。蛋白溶液的 pH 值需保持在 8.5±0.5，如果低于 8.0，使用 1 M 碳酸氢钠进行调节。若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率将显著下降，建议最终蛋白浓度为 2-10 mg/mL。蛋白须在不含伯胺（如 Tris 或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中制备，否则会影响标记效率。二、染料制备：以 CY7.5-NHS ester 为例，加入无水 DMSO 以制备 10 mM 储备液，并通过移液器或涡旋混合均匀。三、染料用量的计算：所需的 CY7.5-NHS ester 的量依赖于待标记蛋白的量，最佳摩尔比为 10。例：若使用 500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY7.5-NHS ester，需 CY7.5-NHS ester 体积 5.6 μL，计算见下：1) mmol (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10^-6 mmol；2) mmol (CY7.5 NHS ester) = 6.7×10^-6 mmol × 10 = 6.7×10^-5 mmol；3) μL (CY7.5 NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol × 833.76 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 5.6 μL。四、运行偶联反应：将适量新鲜制备的 10 mg/mL CY7.5 NHS ester 缓慢加入 0.5 mL 的蛋白质样品中，在溶液中轻轻摇动混匀，然后短暂离心，将样品收集到反应管底部，避免剧烈混匀以防蛋白样品变性失活。在避光条件下于室温下轻轻孵育 60 分钟，每 10-15 分钟反转反应。五、纯化偶联物：使用 SepHadex G-25 柱进行纯化，按说明书准备柱，并将反应混合物加载到柱顶，在样品运行到顶部树脂下方后立即添加 PBS(pH 7.2-7.4)。根据需要添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 完成柱纯化，合并含有染料-蛋白质偶联物的级分。