蛋白准备：为确保最佳的标记效果，请将蛋白（抗体）浓度配置为2 mg/mL。1) 当蛋白溶液的pH值低于8.0时，需使用1 M 碳酸氢钠调整至8.5±0.5。2) 若浓度低于2 mg/mL，则标记效率显著降低，建议最终蛋白浓度为2-10 mg/mL。3) 蛋白应置于无伯胺和铵离子的缓冲液中，以免影响标记效率。染料准备：CY染料用无水DMSO稀释成10 mM储备溶液，并通过玻璃管或旋涡充分混合。注意，将CY储备液分装后，于-20℃或-80℃避光保存。染料用量：标记所需的CY染料量由蛋白量决定，CY染料与蛋白的最佳摩尔比为10左右。例如：若需标记500 μL 2 mg/mL的IgG (MW=150,000)，用100 μL DMSO溶解1 mg CY染料，则需3.95 μL CY，具体计算如下（以CY3-NHS ester为例）：1) mmol (IgG) = 6.7×10^-6 mmol 2) mmol (CY3-NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol 3) μL (CY3-NHS ester) = 3.95 μL (CY3-NHS ester)。使用方法：标记反应：1) 将新配制的10 mg/mL CY染料缓慢加入0.5 mL蛋白样品溶液，轻轻摇匀混合后短暂离心。2) 在避光处室温摇晃孵育60分钟，每10–15分钟轻轻颠倒以提高标记效率。蛋白纯化脱盐：使用SepHadex G-25柱。1) 准备SepHadex G-25柱。2) 将反应混合物装入柱顶部。3) 样品到达树脂下方时，立即加入PBS (pH 7.2-7.4)。4) 继续加入PBS至柱纯化完成，收集含有染料-蛋白质缀合物的组分。