指南 (以下方案为推荐指南，请根据具体需求进行调整)。 1. 溶液配置 1.1 储存液溶剂：DMSO。建议配制浓度为 20 mM。储存条件：分装后于 -20°C 或 -80°C 避光保存，避免重复冻融。1.2 工作液使用 PBS 或无血清培养基稀释至 20 μM（需根据实验进行优化）。注意：工作液应现配现用，并避光。2. 细胞标记（例如 A549 细胞）：2.1 以 3×10^4 的细胞密度将 2 mL 生长的种子细胞接种到 35 毫米玻璃底培养皿中。2.2 加入 Ac4ManNAz（终浓度 50 μM），孵育 3 天（在细胞表面产生叠氮基团）。2.3 使用 DPBS (pH 7.4) 洗涤细胞两次。2.4 以 Cyanine5 DBCO（终浓度 20 μM）在 37℃ 孵育细胞 1 小时。2.5 使用 DPBS (pH 7.4) 冲洗细胞，并用甲醛-戊二醛联合固定液在 25°C 固定 15 分钟。2.6 用 DPBS (pH 7.4) 洗涤细胞两次，并用 DAPI 染色以标记细胞核。2.7 使用共聚焦激光扫描显微镜测量 Cyanine5 DBCO 荧光（Ex=635 nm，Em=650-700 nm）。注意：1) 经过 Ac4ManNAz 处理后，Cyanine5 DBCO 可以靶向定位到细胞表面引入的叠氮基团，并持续超过 3 天。2) Cyanine5 DBCO 标记的程度为剂量依赖型。