CY染料溶液制备：1. 蛋白准备：为达到最佳标记效果，应将蛋白 (抗体) 浓度调至2 mg/mL。1) 蛋白溶液的pH值应为8.5±0.5，如低于8.0，需用1 M碳酸氢钠调整。2) 如果蛋白浓度低于2 mg/mL，标记效率将大大降低，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg/mL。2. 染料准备：用无水DMSO稀释CY染料，配成10 mM储备溶液，通过玻璃管或旋涡充分混合。请将CY储备液分装后避光保存在-20 ℃或-80 ℃下。3. 染料工作液用量的计算：CY染料的用量取决于所标记蛋白的用量，最佳CY与蛋白摩尔比约为10。例：若需标记500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000)，用100 μL DMSO溶解1 mg CY染料，则所需CY体积为3.95 μL，具体计算过程如下 (以CY3-NHS ester为例)：1) mmol (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10-6 mmol。2) mmol (CY3-NHS ester) = 6.7×10-6 mmol × 10 = 6.7×10-5 mmol。3) μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10-5 mmol × 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 3.95 μL (CY3-NHS ester)。

使用方法：1. 标记反应：将10 mg/mL的CY染料按照计算好的体积缓慢加入到0.5 mL的蛋白样品中，轻轻摇匀再短暂离心使样品沉积于管底，避免剧烈混合以防止蛋白变性。将反应管置于避光处，在室温下轻轻摇晃孵育60分钟，每隔10–15分钟颠倒反应管数次，以提高标记效率。2. 蛋白纯化脱盐：下面的步骤以使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物为例：1) 按照说明书准备Sephadex G-25柱。2) 将反应混合物装入G-25柱顶部。3) 当样品到达上方树脂表面以下时，立即加入PBS (pH 7.2-7.4)。4) 不断加入PBS (pH 7.2-7.4)以完成纯化并收集含有目标染料-蛋白质缀合物的组分。可选：如果蛋白不含游离半胱氨酸，需使用硫醇还原剂，如DTT或TCEP，它们会还原二硫键以产生两个游离硫醇基团。在马来酰亚胺染料与蛋白质结合前必须移除游离DTT，例如通过透析。