操作指南（仅供参考）一、蛋白制备：首先，将蛋白（抗体）浓度调整至2 mg/mL，以实现最佳标记效果。确保蛋白溶液的pH值保持在8.5±0.5。如果低于8.0，请用1M碳酸氢钠调节。若蛋白浓度不足2mg/mL，标记效率会显著下降，故建议蛋白终浓度为2-10 mg/mL。应使用不含伯胺（如Tris或甘氨酸）的缓冲液，同时避免铵离子的存在，以免影响标记效果。二、染料制备：以CY3-NHS酯为例，将无水DMSO加入CY3-NHS酯小瓶中，制成10 mM储备液，使用移液器或涡旋混合均匀。三、染料用量的计算：所需CY3-NHS酯的量基于待标记蛋白的量，并取CY3-NHS的最佳摩尔比约为10。例：在500 μL的2 mg/mL IgG（MW=150,000）中溶解1 mg的CY3-NHS ester于100 μL DMSO中，结果CY3-NHS ester体积为5.05 μL，具体计算如下：1) mmol (IgG)=2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10⁻⁶ mmol；2) mmol (CY3-NHS酯)=6.7×10⁻⁶ mmol × 10 = 6.7 × 10⁻⁵ mmol；3) μL (CY3-NHS酯)=6.7 ×10⁻⁵ mmol × 753.88 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 5.05 μL。四、运行偶联反应：将新鲜制备的10 mg/mL CY3-NHS酯缓慢加入0.5 mL蛋白质样品中，轻轻摇动混匀，短暂离心后收集在反应管底部，以免混匀，导致蛋白样品变性失活。反应管应置于避光处，室温下间隔10-15分钟，轻轻孵育60分钟，以逆转反应。五、纯化偶联物：以下步骤使用SepHadex G-25柱进行纯化。1) 按照制造说明准备SepHadex G-25柱；2) 将反应混合物加载到SepHadex G-25柱顶部；3) 样品进入树脂表面后，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）；4) 继续添加PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱纯化，合并所需染料-蛋白质偶联物级分。