Protocol 一、蛋白制备 1) 为了达到最佳标记效果，需要准备浓度为 2 mg/mL 的蛋白 (抗体)。2) 确保蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果低于 8.0，须使用 1 M 碳酸氢钠调整。3) 若蛋白浓度不足 2 mg/mL，标记效率将显著下降。理想的浓度范围是 2-10 mg/mL。4) 蛋白应保存在无伯胺和铵离子的缓冲液中，以免影响标记。二、染料制备 向 Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA 小瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 储备液，混合均匀。三、计算染料用量 标记所需的 Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA 的量取决于待标记蛋白的数量，染料与蛋白的摩尔比约为 10。例：如果 marker protein 为 500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000)，使用 100 μL DMSO 溶解 1 mg Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA，所需的 Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA 体积为 7.76 μL，计算如下：1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) × mL (IgG)/MW (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL/150,000 mg/mmol= 6.7×10^-6 mmol 2) mmol (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA) = mmol (IgG) × 10 = 6.7×10^-6 mmol×10=6.7 × 10^-5 mmol 3) μL (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA) = mmol (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA) × MW (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA)/mg/μL (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA) = 6.7 × 10^-5 mmol × 1158.29 mg/mmol/0.01 mg/μL = 7.76 μL (Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA) 四、进行偶联反应 1) 将适量10 mg/mL 的 Alexa Fluor 680 NHS ester diTEA 加入 0.5 mL 蛋白样品中，轻轻混匀并短暂离心，但勿剧烈混合以免蛋白损坏。2) 反应管置于避光环境中，室温孵育 60 分钟，并每 10-15 分钟轻轻颠倒。五、纯化偶联物 以下为使用 SepHadex G-25 柱进行纯化的示例：1) 按说明准备 SepHadex G-25 柱。2) 加载反应混合物到柱顶。3) 样品运行至树脂表面下方时，添加 PBS (pH 7.2-7.4)。4) 加入更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成纯化，合并含有目标偶联物的级分。