3X HA Tag 常用于融合蛋白的 Western blot 和免疫荧光检测，下面以 pCDNA3-VAMP8-3xHA为例，介绍下实验的操作步骤：
一、接种细胞
1.在 24 孔板的每孔中加入总共 1.5 × 10^4 个细胞.
2.移至 37 °C 培养箱中过夜。
二、使用 JetPrime 转染 HeLa 细胞
1.从每个孔中取出培养基，用 0.5 ml 完整的 DMEM 替换。
2.加入 500 ng pCDNA3-VAMP8-3xHA，并用 JetPrime 缓冲液调节至终体积为 100 μl。
3.室温下孵育 10 -15分钟。
4.每孔加入 15 μl 转染混合物。
5.在 37 °C 下在组织培养箱中孵育 6 小时。
6.取出培养基并更换为 1.5 ml 完整的 DMEM。
7.在 37 °C 组织培养箱中孵育过夜。
三、VAMP8 内吞摄取测定
1.用 1 ml 冰冷的 DMEM 洗涤转染的细胞。再重复一次，总共洗涤两次。
2.在冰冷的完全 DMEM 中稀释兔抗 HA 抗体，最终稀释度为 1：200。
向每个孔中加入 150 μl 稀释的抗 HA 抗体。
3.在冰上孵育 60 分钟，偶尔摇晃。
4.用 1 ml 冰冷的完整 DMEM 洗涤细胞 3 次。
5.用 1 ml 预热的 EBSS （37 °C） 洗涤细胞两次。
6.向每个孔中加入 1 ml 预热的 EBSS，并在 37 °C 组织培养箱中孵育 15、45 和 90 分钟。
三、免疫荧光
1.在每个时间点，取下适当的盖玻片，并转移到含有 1 ml 1× PBS 的新 24 孔板的新孔中。
2.取出 1× PBS，并替换为 1 ml 4% 多聚甲醛溶液。
3.在室温下孵育 15 分钟。
4.去除 4% 多聚甲醛溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
5.去除最后一次洗涤并在室温下在 1 ml 封闭缓冲液中封闭 1 小时。
6.在抗体孵育缓冲液中，将小鼠抗 Lamp1 或小鼠抗 EEA1 分别稀释至 1：100 或 1：1,000 的最终稀释度。
7.去除封闭缓冲液，用 100 μl 适当的稀释抗体替换，并在 4 °C下孵育。
8.去除稀释的抗体溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
9.稀释 Alexa 偶联的二抗。在抗体稀释缓冲液中，将山羊抗小鼠 Alexa-488 和山羊抗兔 Alexa-546 稀释至 1：250 的最终稀释度。
10.去除洗涤液，加入 200 μl 稀释的二抗溶液，并在室温下避光孵育 1 小时，以尽量减少光漂白。
11.取出含二抗的溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤 3 次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
12.加入 200 μl 含有 1 μg/ml DAPI 的 1× PBS，并在室温下孵育 5 分钟。
13.去除含 DAPI 的溶液，用 1 ml 1× PBS 洗涤两次。每次洗涤，在室温下孵育 5 分钟。
14.将 10 μl FluorSave 封固剂吸取在显微镜载玻片上。
15.在适当的共聚焦或宽场显微镜系统上成像。[2]