3× FLAG peptide is a FLAG peptide tag composed of three repeated Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp motifs, used for protein identification and purification.

3× FLAG peptide常用于抗Flag树脂、磁珠等的洗脱，以纯化人组氨酸-tRNA 合成酶(HARS)的步骤为例：
1.收获瞬时转染了 HARS 表达质粒的 HEK293 细胞，并在含有哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物的 CelLytic M 缓冲液中， 4 °C 下裂解 20 分钟。
2.将 FLAG 标记的 HARS 与抗 DYDDDDK 树脂结合纯化，并在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 和 150 mM NaCl 的缓冲液中与 3× FLAG peptide 竞争洗脱。
3.分离的 FLAG-HARS 进一步采用 HiTrapQ HP 柱 (GE Healthcare) 纯化，并用 NaCl 梯度洗脱至 150–500 mM。
4.通过 SDS-PAGE 鉴定含有 HARS 的各个级分，合并后在 4°C 下透析到标准缓冲液中，该缓冲液由 50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、10 mM MgCl2 和 5 mM β-巯基乙醇 (β-ME) 组成。
5.透析后，使用 Amicon Ultra-4 离心过滤器 (Millipore) 浓缩样品，然后通过添加 80% 甘油稀释，使最终甘油浓度为 40%。
6.通过 A280 测定蛋白质浓度并储存在 −20°C。经 SDS-PAGE 分析，制剂中的 HARS 含量大于 99%（数据未显示）。
7.通过活性位点滴定26、27 测定每种酶制剂的活性，在快速化学猝灭的预稳态条件下监测组氨酸存在下 α 标记的 32P-AMP 的外观。
准备两个注射器：一个注射器中，将浓度为5 μM的酶与饱和组氨酸、5 mM MgCl2和8 U/mL焦磷酸酶（PPiase）的标准缓冲液一起孵育；另一个注射器中，将ATP与标准缓冲液一起孵育。
8.反应用400 mM NaOAc（pH 4.5）和0.1% SDS猝灭，然后用薄层色谱法分析产物。[1]