Reactive Oxygen Species Assay Kit for Superoxide Anion (DHE)

100 T规格的产品组成如下：

1. 灵敏度高。
2. 对照体系完善。
3. 适用于多种样本类型。
4. 兼容多种检测仪器。
5. 实验重复性好。

细胞内氧化应激检测、氧化还原信号通路研究、氧化应激相关药物研发、环境毒理学评估。

一、阳性对照的设置
建议使用试剂盒提供的超氧阴离子阳性对照Rosup（1000×），按1:1000稀释。加入细胞后于37°C避光孵育0.5–2 h，具体孵育时间可根据细胞类型进行优化。在阳性对照处理结束后，按照后续检测方法加入DHE染色液进行染色与检测。
二、DHE工作液配制
用适宜稀释液（无血清培养基或PBS）将DHE储备液稀释成浓度为1×的工作液。
注：DHE易被空气中的氧气氧化，在操作中应尽量减少其与空气的接触，DHE工作液需现配现用，避免因长时间暴露于空气中导致试剂失效。
三、荧光显微镜检测
1.将细胞接种于 96 孔板、细胞培养皿或载玻片上，待细胞稳定后按实验方案处理。
2.（可选）贴壁细胞：吸除培养液，用PBS洗涤一次。悬浮细胞：250–1000×g离心5 min，弃上清后用PBS洗涤一次。
注：若使用含酚红或血清的培养基，建议充分吸除培养液，以减少背景干扰。
3.加入足量稀释后的DHE工作液，确保液体完全覆盖细胞。以96孔板为例，单孔推荐加入≥100 µL。于37°C培养箱中孵育20 min（可根据实际情况在10-30 min内调整）。
4.孵育后可直接在荧光显微镜下观察。若背景荧光偏高，可酌情用PBS洗涤1–3次后再观察。DHE 荧光参数：Ex/Em = 535/610 nm。
四、流式细胞仪检测
1.将细胞接种于 6 孔板或培养皿中，待细胞稳定后按实验方案处理。
2.贴壁细胞用胰酶消化，PBS洗涤一次；悬浮细胞250–1000×g离心5 min，弃上清后用PBS洗涤一次。建议每组准备约1×10^6个细胞。
3.将细胞重悬于1 mL DHE染色液中，形成单细胞悬液。于37°C培养箱中孵育20 min（可根据实际情况在20-30 min内调整），期间每隔3–5 min轻轻颠倒混匀，以促进探针进入细胞。孵育后可使用适宜稀释液（无血清培养基、PBS或HBSS）洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的多余探针。
4.可直接上机进行流式检测，或离心后重悬于0.5 mL检测缓冲液中进行检测。DHE 荧光参数：Ex/Em = 535/610 nm。
注：流式检测灵敏度较高，染料使用浓度可适当降低，请根据细胞类型调整DHE浓度或稀释倍数。
五、荧光酶标仪检测
1.将细胞接种于黑色透明底96孔板，每孔接种100–10,000个细胞，推荐范围为2000–5000个。按实验方案处理细胞。
2.（可选）贴壁细胞：吸除培养液，用PBS洗涤一次。悬浮细胞：250–1000×g离心5 min，弃上清后用PBS洗涤一次。
3.加入100 µL稀释后的DHE工作液，确保液体完全覆盖细胞。于37°C培养箱中孵育20 min（可根据实际情况在10-30 min内调整）。
4.孵育后可直接使用荧光酶标仪进行检测，若背景荧光偏高，可酌情用PBS洗涤1–3次后再观察。DHE 荧光参数：Ex/Em = 535/610 nm。通过比较对照组和处理组的 RFU 值（相对荧光强度）评估活性氧变化水平。

-20℃避光保存，一年有效。本品易被氧化，尽量避免暴露于空气中。

1. 对于不同的细胞，Rosup的效果可能有较大的差别，可能对某些细胞效果较弱或者完全没有效果。可以根据预实验结果适当调整阳性对照的浓度。
2. 由于样本类型和实验环境的不同均会影响染色效率，建议通过预实验来优化探针工作液浓度和染色时间。
3. 若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以适当降低探针浓度。
4. 结果检测前重悬细胞的密度由细胞荧光强度决定，如果荧光强，则降低细胞密度，减少用于重悬的无血清培养基体积，反之亦是。同时应保证所有处理组样本的细胞密度保持一致。
5. 光照易导致荧光淬灭，操作过程应注意避光。
6. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
7. 为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。

A549细胞用Rosup处理1 h后，用DHE探针检测荧光。

• C0179-超氧阴离子活性氧检测试剂盒 (DHE)说明书-中文 (1.4 MB)