Reactive Oxygen Species Assay Kit

100 T规格的产品组成如下：

1. 灵敏度高。
2. 对照体系完善。
3. 适用于多种样本类型。
4. 兼容多种检测仪器。
5. 实验重复性好。
6. 操作简便。

氧化应激信号通路研究、细胞代谢调控研究、抗氧化药物筛选、药物毒性检测。

一、探针装载
根据刺激时长选择合适的探针装载方式：
短时间刺激（通常≤2 h）：建议先装载探针，再使用活性氧阳性对照（Rosup）或实验药物刺激细胞。
长时间刺激（通常≥6 h）：建议先进行药物处理或Rosup刺激，后装载探针。
A.原位装载法（适用于贴壁细胞）
1.实验前一天将细胞接种于合适培养板中，确保检测时细胞融合度达到50–70%。
2.去除培养液，根据实验设计加入适当浓度的药物，在37°C避光孵育，刺激时间根据药物特性与细胞类型而定。
阳性对照（可选）：按1:1000稀释Rosup（1000×），终浓度为1×。加入细胞后于37°C避光孵育0.5–4 h。
3.按1:1000用适宜稀释液（无血清培养基、PBS或HBSS）稀释DCFH-DA，终浓度为1×。
4.去除细胞培养液，加入足量稀释后的DCFH-DA工作液，确保液体完全覆盖细胞。以六孔板为例，单孔推荐加入≥1 mL。于37°C培养箱中孵育20-30 min。
5.孵育结束后，使用适宜稀释液（无血清培养基、PBS或HBSS）洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的多余探针。
B.细胞收集后装载法（适用于贴壁细胞与悬浮细胞）
1.按常规方法培养细胞，收集并洗涤后获得足量细胞悬液。
2.根据实验设计加入适当浓度的药物，在37°C避光孵育，刺激时间根据药物特性与细胞类型而定。
阳性对照（可选）：按1:1000稀释Rosup（1000×），终浓度为1×。加入细胞后于37°C避光孵育0.5–4 h。
3.按1:1000用适宜稀释液（无血清培养基、PBS或HBSS）稀释DCFH-DA，终浓度为1×。
4.收集细胞后，重悬于稀释后的DCFH-DA溶液中，调整细胞密度为1×10^6 ~ 2×10^7个/mL。于37°C培养箱中孵育20-30 min，期间每隔3–5 min轻轻颠倒混匀，以促进探针进入细胞。
5.孵育后，使用适宜稀释液（无血清培养基、PBS或HBSS）洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的多余探针。
6.洗涤完成后，可直接进行药物或阳性对照刺激，或将细胞分组后进行刺激处理。
二、荧光检测
A.原位装载样品：可直接使用激光共聚焦显微镜观察，或收集细胞后使用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪进行检测。
B.收集后装载样品：适用于荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测，也可直接观察荧光显微图像。
注：激发波长（Ex）：488 nm，发射波长（Em）：525 nm。可进行实时监测或多时间点采样，对比刺激前后的荧光强度变化。

-20℃避光保存，一年有效。

1. 对于不同的细胞，Rosup的效果可能有较大的差别，可能对某些细胞效果较弱或者完全没有效果。可以根据预实验结果适当调整阳性对照的浓度。
2. 由于样本类型和实验环境的不同均会影响染色效率，建议通过预实验来优化探针工作液浓度和染色时间。
3. 若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以适当降低探针浓度。
4. 结果检测前重悬细胞的密度由细胞荧光强度决定，如果荧光强，则降低细胞密度，减少用于重悬的无血清培养基体积，反之亦是。同时应保证所有处理组样本的细胞密度保持一致。
5. DCF荧光容易淬灭，染色完成的样本尽量在2 h内检测。操作过程应注意避光。
6. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
7. 为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。

A549细胞用Rosup处理1.5 h后，用DCFH-DA探针检测荧光。

• C0177-活性氧检测试剂盒说明书-中文 (1.4 MB)