DFHBI is a small molecule, resembles the chromophore of green fluorescent protein (GFP). Spinach and DFHBI are essentially nonfluorescent when unbound. The Spinach-DFHBI complex is brightly fluorescent both in vitro and in living cells.

菠菜和菠菜2与DFHBI结合时，具有447 nm的荧光激发峰和501 nm的荧光发射峰[1]，它们是可以用于遗传编码荧光RNA的RNA适体。菠菜是一个98-nt长的RNA适体，能够结合DFHBI并激活其荧光。当未结合时，菠菜和DFHBI基本上不发荧光，而菠菜-DFHBI复合体在体外和活细胞中则表现出明亮的荧光。菠菜2能够结合并激活DFHBI的荧光，使得可以在活细胞中成像观察菠菜2标记的RNA的动态定位。菠菜2的光谱特性受DFHBI限制，后者产生的荧光为蓝绿色，并不适用于荧光显微镜中常用的滤光片。应避免DFHBI暴露于光照。所有DFHBI的原液应保存在黑暗的试管中或用箔纸包裹。含有DFHBI的培养皿应使用箔纸包裹以避免光照[2]。

一、RNA标记与成像
1.准备Spinach RNA：合成含Spinach适配体序列的目标RNA，采用体外转录或RNA合成方法。
2. DFHBI溶解：将DFHBI溶解于DMSO或水中，制成1-10 mM的储备液，使用时稀释至1-50 µM范围。
3. 复合物形成：将Spinach RNA与DFHBI混合，在适当的缓冲条件（如Tris-HCl、MgCl₂等）下孵育，以形成高荧光复合物。
3.成像：使用荧光显微镜观察，激发波长为470-490 nm，发射波长为510-530 nm。
二、活细胞实验
1. Spinach RNA表达：使用含Spinach序列的质粒转染细胞，或者通过体内RNA合成系统表达目标RNA。
2.加入DFHBI：向细胞培养基中添加DFHBI（终浓度通常为10-50 µM），孵育10-30分钟。
3. 荧光检测：在荧光显微镜或荧光成像仪下观察，监测RNA的定位和动态。
4 荧光检测与定量
1） 荧光测量：使用荧光分光光度计定量Spinach-DFHBI复合物的荧光强度，用于分析RNA的量或动态变化。
2）优化条件：在实验中优化缓冲液、离子浓度（尤其是Mg²⁺浓度）和pH，以获得最佳荧光信号。