5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine), a rhodamine dye, exhibits strong fluorescence property in aqueous buffer with the λexit of 580 nm (ε=3.6×10^4/(M·cm)), and λemit of 604 nm (ϕ=0.94).

一、核酸或蛋白质标记
1. 材料准备：
1）5-ROX 染料（通常为 NHS 酯或琥珀酰亚胺酯形式）。
2）核酸或蛋白质样品。
3）缓冲液（如 0.1 M NaHCO₃，pH 8.5）。
4）有机溶剂（如 DMSO 或 DMF，用于溶解染料）。
2. 标记步骤：
1）溶解染料：将 5-ROX 染料溶解于无水 DMSO 或 DMF 中，浓度通常为 10 mM。
注意事项：染料溶液应避光操作，并尽量在短时间内使用。
2）准备标记反应：在核酸或蛋白质样品中加入 5-ROX 溶液，通常按 10:1 的摩尔比（染料:目标分子）；反应体系中需加入适量缓冲液（如 0.1 M NaHCO₃，pH 8.5），确保反应环境适合酰胺键的形成。
3） 孵育：在室温下孵育 1–2 小时（蛋白标记）或 2–4 小时（核酸标记），避免强光照射。
4）纯化：使用超滤离心管、凝胶过滤柱或 HPLC 纯化未结合的染料分子。
5）储存：将标记产物溶解在适当缓冲液中（如 TE 缓冲液），并避光存放于 -20°C。
二、实时 PCR（qPCR）应用
1. 材料准备：
1）5-ROX 荧光染料。
2）实时 PCR 反应混合物（包含模板、引物、探针及聚合酶）。
3）适当的荧光检测设备（如具有橙红光通道的 qPCR 仪）。
2. 使用步骤：
1）添加 5-ROX：根据设备要求添加适量 5-ROX（通常为每 50 μL 反应体系中加入 50–100 nM 的最终浓度）。
2）混合均匀：轻轻混匀反应液，避免产生气泡。
3）运行 PCR：在设备支持的波长范围内进行荧光信号检测（激发 ~580 nm，发射 ~600 nm）。
注意事项：
1）避光操作：5-ROX 对光敏感，操作和存储时需尽量避光，推荐短期储存于 4°C，长期储存于 -20°C。
2）溶剂选择：使用无水 DMSO 或 DMF 以确保染料的稳定性。
3）标记效率优化：样品的 pH 和染料浓度需根据目标分子的特性调整，以优化标记效率。
4）安全性：避免皮肤接触和吸入，操作时佩戴手套和护目镜。