Reducing Sugar Assay Kit (Microanalysis)

加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、样品中还原糖的提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0129M-A（mL）为 500~1000：1 的比例，建议 1000 万细菌或细胞加入 2mL CB0129M-A，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10次， 8000g，常温离心 10min，取上清供测定用。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0129M-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.2g 组织，加入 2mL CB0129M-A），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃ 水浴中 40min 并且振荡 8~10次，8000g，常温离心 10min，取上清供测定用。
3.血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：CB0129M-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取 0.2mL 血清（浆）加入1.8mL CB0129M-A），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10次，8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2.标准品准备：临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解成10mg/ml的标准品原液备用（4℃可保存1周），再将标准品用蒸馏水稀释至 0.25、 0.2、0.15、0.1、0.05 mg/mL。
3.在 EP 管中加入下列试剂：

四、ICDHc 活力单位的计算：
a.按微量石英比色皿计算：
1.血清(浆)ICDHc 活力的计算：
单位的定义：每 mL 血清(浆)每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样本÷T=1608×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 ICDHc 活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T =1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取×V样本) ÷T=1608×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/10⁴ Cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样本×500)÷T=3.2×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万
b.按96 孔板计算：
将上述公式中光径 d-96 孔板光径改为 0.5cm。

1.对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完CB0098S-A、B、C、D、E后必须马上加CB0098S-F；测定管加完CB0098S-A、B、C、D、E后必须反应 20min 后再加CB0098S-F。
2.操作及反应过程中注意避光。
3.由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测24个NAD⁺ 或NADH。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。