Reducing Sugar Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。

50T/24S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、样品中还原糖的提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0129V-A（mL）为 500~1000：1 的比例建议 1000 万细菌或细胞加入 2mL CB0129V-A，超声波破碎细菌或细胞，冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10次， 8000g，常温离心 10min，取上清供测定用。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0129V-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.2g 组织，加入 2mL CB0129V-A），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃ 水浴中 40min 并且振荡 8~10次，8000g，常温离心 10min，取上清供测定用。
3.血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：CB0129V-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取 0.2mL 血清（浆）加入1.8mL CB0129V-A，冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10次，8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2.标准品准备：临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解成10mg/ml的标准品原液备用（4℃可保存1周），再将标准品用蒸馏水稀释至 0.25、0.2、0.15、0.1、0.05mg/mL。
3.在 EP 管中加入下列试剂：

4.实验时，试剂B、试剂C和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液 37℃水浴放置。

四、NAD⁺和 NADH 含量的计算：
一. NAD⁺含量的计算：
1.血清(浆)中 NAD⁺含量计算
NAD⁺含量 (nmol/mL) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷V血清=25×ΔA测定÷ΔA标准1
2.组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD⁺ (nmol/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷(V提取×Cpr)=2.5×ΔA测定÷ΔA标准1 ÷ Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD⁺ (nmol/g 鲜重) = ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷W=2.5×ΔA测定÷ΔA标准1÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD⁺ (nmol/10⁴ cell) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷500=0.005×ΔA测定÷ΔA标准1
二. NADH 含量的计算：
1.血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量 (nmol/mL) =ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷V血清=25×ΔA测定÷ΔA标准2
2.组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot) = ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷(V提取×Cpr)=2.5×ΔA测定÷ΔA标准2 ÷ Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重) = ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷W=2.5×ΔA测定÷ΔA标准2÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10⁴ cell) =ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷500=0.005×ΔA测定÷ΔA标准2
注：C标：NAD或NADH标准溶液的浓度1.25nmol/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；2：提取过程中上清液稀释倍数； V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：500 万个细胞。

1.若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
2.若 A2-A1 小于 0.005，可延长反应时间到 5min 或 10min。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。