PL Assay Kit (Microanalysis)

果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰，测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、天平、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

二、酶液提取
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0297M-ES），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.细胞、细菌或真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL CB0297M-ES），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测（细菌、真菌等难以数量计算的微生物也可以称取 0.1g 细菌/真菌沉淀来 进行前处理）。
3.细胞培养液等：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至235nm，蒸馏水调零。
2.操作表（在EP管中依次加入）

四、酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.组织中PL活性
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×Cpr)÷T = 64.1×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/g 鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×W÷V样总)÷T = 64.1×△A÷W
2.细胞、细菌或真菌PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每10⁴个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/10⁴ cell) = △A ÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T = 64.1×△A÷N
3.培养液PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/mL) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷V样÷T = 64.1×△A
注：ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min；10⁹：换算系数，1mol=10⁹nmol；N：细胞数量，以万计。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.组织中PL活性
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×Cpr)÷T = 128.2×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/g 鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×W÷V样总)÷T = 128.2×△A÷W
2.细胞、细菌或真菌PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每10⁴个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/10⁴ cell) =△A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T = 128.2×△A÷N
3.培养液PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性 (U/mL) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷V样÷T = 128.2×△A
注：ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min；10⁹：换算系数，1mol=10⁹nmol；N：细胞数量，以万计。

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。