PC Assay Kit (Microanalysis)

PC催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD⁺，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL CB0283M-ES，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆600g，4℃离心5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。
5.在步骤4的沉淀中加入1mL CB0283M-ES，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PC活性测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.工作液的配制：临用前将CB0283M-B和CB0283UV-C转移到CB0283M-A中混合溶解待用。
3.置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4.CB0283M-D的配制：在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
5.测定操作表（微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂）：

四、PC活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1608×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =3.215×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 3216×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 3216×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =6.43×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。