γ-glutamyl-cysteine ligase Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

Name: γ-glutamyl-cysteine ligase Assay Kit (Visible Spectrophotometry)
Brand: TargetMol
SKU: CB0108V
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0108V

别名 γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性检测试剂盒（可见分光光度法）

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-glutamylcysteine ligase, GCL）是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL 基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL 活性高低对 GSH 含量和 GSH/GSSG 比值有重要影响。

规格	价格	库存	数量
50 T	¥ 418	6-8日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

在 ATP 和 Mg2+存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出 GCL 活性。

产品规格

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

	规格	储存条件
CB0108V-A	70mL×1瓶	4℃保存；
CB0108V-B	粉剂×1 瓶	4℃保存；临用前加 14 mL 蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融；
CB0108V-C	粉剂×1 瓶	4℃保存；临用前加入蒸馏水 3.5 mL 充分震荡溶解；
CB0108V-D	16mL×1 瓶	室温保存；
CB0108V-E	粉剂×1 瓶	4℃保存；临用前加入 30mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入 1.0 mL 浓硫酸（自备），边加边搅拌。

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计、1ml 玻璃比色皿、冷冻离心机、水浴锅、移液器、浓硫酸和蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0108V-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0108V-A）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：CB0108V-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL CB0108V-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min，调节波长到 660nm，蒸馏水调零。
2.取1.5mLEp 管，依次加入下列试剂：

试剂名称	空白管（µL）	测定管（µL）
CB0108V-A	360	240
CB0108V-B	260	260
CB0108V-C	60	60
粗酶上清液		120
混匀后盖紧，37℃水浴准确反应 15min；
CB0108V-D	300	300
混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心 10 min；
取上清	500	500
CB0108V-E	500	500
混匀后盖紧，45℃水浴 10min，冷却后测定 660nm 处光吸收，记为 A空白管、A 测定管。

注意：空白管只需测定一次。

四、GCL 活性计算公式：
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义： 37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/mg prot) =[(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(Cpr×V样)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义： 37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/g) = [(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每10⁴个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL (μg/min /10⁴ cell) = [ (A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位
GCL (μg/min /mL) = [(A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷V样÷T=3.815×(A测定管-A空白管)
注：V反总：反应总体积(mL)980µL=0.980mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，120µL =0.12 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间：15min；细胞数量：以10⁴为单位计算，万个。

注意事项

1.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
2.CB0108V-C配制完后请于1周内用完。
3.实验过程请带手套，CB0108V-C中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。
4.测定吸光值时请于水浴后 10～40 分钟内测完。
5.样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值大于1，应先用CB0108V-A（或生理盐水）稀释到适当倍数，哺乳动物组织和血液一般稀释 3～5 倍。
6.CB0108V-E配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。
7.细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GCL 的提取时可CB0108V-A（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
8.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。