γ-glutamyl-cysteine ligase Assay Kit (Microanalysis)

在 ATP 和 Mg2+存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出 GCL 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、冷冻离心机、水浴锅、移液器、浓硫酸和蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0108M-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0108M-A）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（10 4 个）：CB0108M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL CB0108M-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 660nm，蒸馏水调零。
2.取1.5mLEp 管，依次加入下列试剂：

四、GCL 活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.1427x，R² = 0.9987
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义： 37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/mg prot) =[(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(Cpr×V样)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义： 37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/g) = [(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min /10⁴ cell) = [ (A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =3.815×(A测定管-A空白管)÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位
GCL (μg/min /mL) = [(A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷V样÷T=3.815×(A测定管-A空白管)
注： 0.1427：回归方程系数；V反总：反应总体积(mL)196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； V样：加入反应体系中上清液体积，24µL = 0.024mL；V样总：提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；T：反应时间：15min。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.07135x，R² = 0.9987
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义： 37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/mg prot) =[(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(Cpr×V样)÷T =7.63×(A测定管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义： 37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min/g) = [(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T =7.63×(A测定管-A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min /10⁴ cell)=[(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =7.63×(A测定管-A空白管)÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义： 37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。
GCL (μg/min /mL) = [(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷V样÷T =7.63×(A测定管-A空白管)
注： 0.07135：回归方程系数；V反总：反应总体积(mL)196 µL= 0.196 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； V样：加入反应体系中上清液体积，24µL = 0.024 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间：15min。

1.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
2.所有试剂配制完后，除表明 4℃保存外，请于 1 天内用完。
3.实验过程请带手套，CB0108M-C中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。
4.测定吸光值时请于水浴后 10～40 分钟内测完。
5.样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值太高，应先用CB0108M-A (或者生理盐水)稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释 3～5 倍。
6.CB0108M-C配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。
7.细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GCL 的提取时可加CB0108M-A（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；
8.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。