EN219-alkyne 探针通过原位标记和沉降实验研究，以 231MFP 细胞为例进行： 首先，用 DMSO 载体或 50 μM EN219-alkyne 探针处理 231MFP 细胞 90 分钟，将细胞在 PBS 中收集并超声裂解。制备蛋白质印迹样品时，将 500 μL 的裂解物中 1 mg 蛋白质分配到每个样品，顺序添加：10 μL 5 mM 生物素吡啶甲酰叠氮化物，50 μL 点击反应混合物（包括三份 5 mM TBTA 的丁醇、DMSO (4:1, v/v)、50 mM Cu(II)SO4 溶液和 50 mM TCEP）。将样品轻柔搅拌，并在室温孵育 1 小时。完成 CuAAC 后，通过 6,500 g 离心沉淀蛋白质，并用预冷的甲醇 (500 μL) 洗涤两次。样品在 4℃ 下预冷离心机中以 6,500 g 离心 4 分钟后，吸去多余的甲醇，并通过探针超声在含有 1.2% SDS 的 250 μL PBS 中重溶蛋白质沉淀。随后，将蛋白质组在 90℃ 下变性 5 分钟，离心沉淀不溶性成分，并将可溶性蛋白质组稀释在 1.2 mL PBS 中，使样品中 SDS 的最终浓度为 0.2%，总体积达 1450 μL，保留 50 μL 作为输入。每个样品中添加 85 μL 预洗的 50% 链霉亲和素琼脂糖珠浆，在室温轻轻搅拌孵育一夜。以 6,500 g 旋转珠子 2 分钟后提取上清液。珠子被转移到旋转柱上并用 PBS 洗涤三次。为了洗脱，珠子在 50 μL LDS 样品缓冲液中煮沸 5 分钟，离心后收集洗脱液并进行免疫印迹分析。En219 (1 μM; 90 min) 与 RNF114 C8、TUBB1 C201、HSPD1 C442 和 HIST1H3A C97 相互作用，isoTOP-ABPP 分析证实。