原液制备：1. 蛋白准备：将蛋白 (抗体) 浓度调至 2 mg/mL，以确保最佳标记效率。1) 当蛋白溶液的 pH 值低于 8.0时，用 1 M 碳酸氢钠调整至 8.5±0.5。2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会显著降低，建议最终浓度为 2-10 mg/mL。3) 蛋白需在不含伯胺和铵离子的缓冲液中。2. 染料准备：用无水 DMSO 配置 CY 染料为 10 mM 储备液，充分混合。注意：将分装的 CY 储存液避光保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃。使用前需以缩合液 (500 μg/mL) 活化。3. 染料工作液用量计算：CY 染料用量根据蛋白量决定，最佳摩尔比为10。如需标记500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000), 用100 μL DMSO溶解1 mg CY 染料，则CY所需体积为3.95 μL, 计算流程如下：1) mmol (IgG) = 2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10-6 mmol; 2) mmol (CY3-NHS ester) = 6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol; 3) μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10-5 mmol×590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 3.95 μL。使用方法：1. 标记反应：用新鲜配制10 mM CY染料活化后，缓慢加入0.5 mL蛋白溶液中，轻轻摇匀，不要过于剧烈以免蛋白变性失活。小管置于避光处，室温孵育60分钟，每10-15分钟轻轻颠倒混合。2. 蛋白纯化脱盐：使用SepHadex G-25柱纯化偶联物。1) 按说明书准备SepHadex G-25柱。2) 将反应物装入柱顶部。3) 样品达树脂表面下方时，立即加入PBS (pH 7.2–7.4) 完成纯化，并收集含有目标缀合物的组分。

Cy5.5 标记的因子 VIIa 专为肿瘤成像设计。经靶向蛋白标记的 Cy5.5 至少 14 天内特异性定位于肿瘤异种移植物，而游离的 Cy5.5 不会积聚于任何异种移植物或器官。这种对肿瘤血管内皮细胞抗组织因子的成像技术可用于检测原发性肿瘤和转移病灶，并监测体内治疗反应。同时，Cy5.5 标记的乳铁蛋白结合 pH/温度敏感的磁性纳米凝胶（Cy5.5-Lf-MPNA 纳米凝胶）被开发为胶质瘤术前 MRI 和术中荧光成像的潜在造影剂。