Coelenteramine 400a (Coelenterazine 400a) is an ideal substrate for Rluc (renal luciferase) in BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) studies involved in in vivo animal imaging.

发光反应
一、溶液配置
1.母液配置：使用乙醇将Coelenteramine 400a 配置成合适浓度的母液（1-10mM）,可根据具体实验情况调整母液的浓度。
2.工作液配置：使用时可以用水/PBS/DMEM稀释成所需浓度的工作液。
二、操作步骤
1.将 10 μL 浓度为 1.0-5.0 mM 的 Coelenteramine 400a 溶液和 10 μL 浓度为 2.01 mg/mL 的 Renilla luciferase (RLuc8.6-53) 溶液与 200 μL 缓冲液混合。
2.使用配备液氮冷却 CCD 探测器的多通道光谱仪记录混合溶液的生物发光光谱。
注意事项：光谱仪的绝对光谱灵敏度需事先用 500 W 光谱辐照度标准灯校准。
3.采用定制的配备光电倍增管 (PMT，H11890 - 01，Hamamatsu Photonics，Japan) 的光度计测定生物发光反应的相关参数。
注意事项：光度计的绝对响应度需用积分球光谱仪校准，通过光度计测量的相对计数值与积分球测量的绝对值绘制线性图来确定。
4. 在试管中，将 5-15 μL 浓度为 10 nM (总计 50-150 fmol) 的 Coelenteramine 400a 溶液预先放入光度计中，然后注入 150 μL 浓度为 20 μg/mL 的荧光素酶溶液 (在 0.1 M GTA 缓冲液中，pH 分别为 6.0、7.0 和 8.0) 启动反应。监测反应直至发光反应完全，从获得的总光子数和荧光素分子数计算生物发光反应量子产率。
5.使用 Lineweaver-Burk 图计算底物 Coelenteramine 400a 的米氏常数 (Km)。计算催化常数 (kcat)。使用 Quantaurus-QY 在激发光设置为 300 nm 的条件下测量相应氧化产物 Coelenteramide 400a (CTMD 400a) 的荧光光谱和绝对荧光量子产率，测量时 CTMD 400a 溶液在 DMSO 中的浓度为 20 μM。[4]