Name: Transhydrogenase-1 Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0176M
Rating: 5 (4 reviews)

规格

价格

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数量

100 T

¥ 3,110

10-12日内发货

检测原理

NADH 和 NADPH 均在 340 nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340 nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代 NADP⁺，TH-1 催化 APADP⁺ 还原生成的 APADPH 在 375 nm 有特征光吸收，因此通过测定 375 nm 光吸收增加速率，来计算 TH-1 活性。

产品规格

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0176M-A	100 mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0176M-B	50 mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0176M-C	180mL×1 瓶	4℃保存。
CB0176M-D	粉剂×1 支	-20℃保存；
CB0176M-E	粉剂×1 支	-20℃保存；

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品的制备：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0176M-A，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆液 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）。
5.步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500μL CB0176M-B，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-2 活性测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 375 nm，蒸馏水调零。
2.工作液的配制：临用前取CB0176M-D、E各一支，将CB0176M-D、E转移到CB0176M-C中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；
3.在微量石英比色皿或 96 孔板中按顺序加入下列试剂：

试剂名称	测定管（μL）
样品	20
工作液	180
混匀，立即记录 375 nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

四、TH-2含量计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 74.5×ΔA÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 149×ΔA÷Cpr

(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性 (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T = 0.149×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性 (nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 149×ΔA÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 298×ΔA÷Cpr

(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min /10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.298×ΔA V 注：反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意事项

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。