Pyruvate Kinase Assay Kit (UV Spectrophotometry)

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

一、自备用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品处理（丙酮酸激酶提取）：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0113UV-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0113UV-ES），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），静置 30min，8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0113UV-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0113UV-ES），进行冰浴匀浆，静置 30min，8000g，4℃离心 10min，取上清待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.工作液的配制：临用前将CB0113UV-B转移至CB0113UV-A中，充分溶解备用，现配现用。
3.将工作液、CB0113UV-C置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10分钟。
4.按照下表操作：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 2 分 20秒时的吸光度 A2，计算∆A=A1-A2。

四、PK 活力单位的计算：
1.血清(浆)PK 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PK (U/mL) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷V样÷T = 2613×△A
2.组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PK (U/mg prot) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷(Cpr×V样)÷T = 2613×△A ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PK (U/g 鲜重) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷(W×V样÷V样总)÷T = 2613×△A ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PK (U/10⁴ cell) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷(500×V样÷V样总)÷T =5.226×△A
注： V反总：反应体系总体积，9.75×10^-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量(g)；500：细菌或细胞总数，500 万。

1.测定过程中CB0113UV-D、样本在冰上放置，以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度尽量保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。