P5CS Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

Name: P5CS Assay Kit (Visible Spectrophotometry)
Brand: TargetMol
SKU: CB0229V
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0229V

别名 吡咯啉-5-羧酸合成酶活性检测试剂盒（可见分光光度法）

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸（ Glu）和鸟氨酸（ Orn）两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxylic acid synthase , P5CS）是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

规格	价格	库存	数量
50 T	¥ 726	10-12日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C过程中分解ATP生成ADP和无机磷，通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定P5CS活性。

产品规格

50T/24S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0229V-A	60 mL×1瓶	4℃保存；
CB0229V-B	6 mL×1瓶	4℃保存；
CB0229V-C	6 mL×1瓶	4℃保存；
CB0229V-D	粉剂×1瓶	4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
CB0229V-E	粉剂×1瓶	4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
CB0229V-F	25mL×1瓶	室温保存；
CB0229V-G	10mL×1瓶（10mmol/L标准磷贮备液）	4℃保存；0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：蒸馏水20倍稀释，充分混均；

定磷剂的配制：按H₂O : CB0229V-D : E : F = 2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、酶液提取：
1.组织样品：按照组织质量（g）：CB0229V-A体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0229V-A），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm。
2.酶促反应（在EP管中加入下列试剂）：

试剂名称	对照管（μL）	测定管（μL）
CB0229V-B		100
样本		100
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min
CB0229V-C	100	100
CB0229V-B	100
样本	100
混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液

3.定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）：

	空白管（µL）	标准管（µL）	对照管（µL）	测定管（µL）
0.5μmol/mL标准磷应用液		100
上清液（μL）			100	100
蒸馏水（μL）	100
定磷试剂（μL）	1000	1000	1000	1000
混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。

注意：
1.由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测 48份P5CS活性。
2.此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3.空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。

四、P5CS酶活性计算：
1.血清(浆)P5CS活力的计算
单位定义：每小时每毫升血清(浆)中P5CS 消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力 (μmol/h/mL) = C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷V样÷T= 9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
2.组织中P5CS活力的计算
(1)按蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每毫克组织蛋白中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力 (μmol/h /mg prot) = C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(Cpr×V样)÷T = 9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每克组织中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力 (μmol/h /g 鲜重) = C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(W× V样÷V样总)÷T = 9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
注：C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.3mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。