Oxidized Glutathione Assay Kit (Microanalysis)

利用谷胱甘肽能和 5,5'-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）(5,5'-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB) 反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有最大光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板 、蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.组织：新鲜组织先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g，放入用CB0168M-A润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml CB0168M-A（组织/CB0168M-A比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g， 4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
2.细胞：收集不少于500万个细胞，先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入1ml CB0168M-A重悬细胞，反复冻融2-3次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
3.血液处理：
血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的CB0168M-A，4℃，8000g离心10分钟，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积CB0168M-A，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。
2.CB0168M-B置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。
3.标准品的稀释：将标准品用1ml蒸馏水溶解，浓度为10mg/ml；再取适当溶液配制浓度为为 50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0μg/mL的标准品（用CB0168M-A十倍稀释后进行稀释）。
4.按下表依次加入下列试剂：

四、GSSG含量计算公式：
以吸光度ΔA标准为横坐标(x)，浓度为纵坐标(y)做标准曲线，然后根据标准曲线，将 ΔA样品带入公式中(x)，计算出样品浓度y(μg/mL)。
1.按蛋白浓度计算：
GSSG(μg / mg prot)=y×V 样÷(V 样×Cpr)=y÷Cpr

2.按样本质量计算：
GSSG(μg /g)= y×V 样÷(V 样÷V 样总×W)= y÷W
3.按细胞数量计算
GSSG(μg /10⁶cell)= y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y ÷细胞数量
4.按照液体体积计算
GSSG(μg / mL)= 2y
注： V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；细胞数量：以10⁶为单位计量：2：血浆(血细胞)稀释一倍。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.因为CB0168M-A中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于测定蛋白含量，需另行测定。
3.若不确定样品中GSSG含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
4.此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在30秒和150秒处完成读数。
5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。