NADP Phosphatase Assay Kit (Microanalysis)

NADPase 能够催化 NADP⁺水解为 NAD⁺和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定 NADPase 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品制备：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至660nm。
2.定磷试剂的配制：按 H₂O: 试剂C:试剂D:试剂E=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
3.标准溶液的制备：将10μmol/mL标准溶液用提取液稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL 的标准液待测，现
用现配。
4.酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）：

5.定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂：）

四、计算公式：
1.标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度(x，μmol/mL)和吸光度ΔA标准(y，ΔA标准)，建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定(y，ΔA测定)带入公式计算样本浓度(x，μmol/mL)。
2.酶活计算：
(1)按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。
NADPase (U/mg prot)=(x×V 总)÷(V样×Cpr)÷T=10x÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
定义：每小时每 g 组织 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。
NADPase (U/g 鲜重)=(x×V 总)÷ (W× V样÷V样总)÷T=10x÷W
注：V 总：酶促反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.04mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；
T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。

1.此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。