Monodehydroascorbate Reductase Assay Kit (Microanalysis)

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出 MDHAR 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、研钵、冰、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、冰和双蒸水。

二、样品处理：
1.组织样品的制备：
组织：按照组织质量（g）：CB0194M-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0194M-A）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、细胞样品的制备：
细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：CB0194M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL CB0194M-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g ，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
3.血清等液体样本：直接测定。

三、测定步骤：
1.可见分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。
2.CB0194M-B在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中按顺序加入下列试剂：

四、MDHAR 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按照样本蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/mg prot) = [△A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T = 804×△A ÷Cpr
2.按照样本重量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1个酶活单位。
MDHAR (U/g) = [△A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T = 804×△A ÷W
3.按照细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/10⁴ cell) = [△A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 804×△A ÷细胞数量
4.按照液体体积计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/mL) = [△A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷V样÷T = 804×△A
注：ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：CB0194M-A体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，W ：样品质量；T：反应时间，2min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：
1.按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/mg prot) = [△A÷(ε÷d)×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T = 1608×△A÷Cpr
2.按样本质量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/g) = [△A÷(ε÷d)×V反总×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T = 1608×△A÷W
3.按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/10⁴ cell) =[△A÷(ε÷d)×V反总×10⁹]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 1608×△A÷细胞数量
4.按液体体积计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。
MDHAR (U/mL) = [△A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷V样÷T = 1608×△A
注：ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：CB0194M-A体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，W ：样品质量；T：反应时间，2min。

1.临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。
2.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。