ICL Assay Kit (Microanalysis)

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品处理：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0274M-ES体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0274M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0274M-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0274M-ES），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.样本测定
（1）工作液的配置，将CB0274M-B和CB0274S-C转移至CB0274M-A中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）在CB0274M-D中加入4mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂：。

四、ICL酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 1608×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T = 1608×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =3.215×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 3216×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 3216×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T =6.25×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。