Pyruvate Dehydrogenase Assay Kit (Spectrophotometry)

PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致 605nm 光吸收的减少。

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0191S-A和 10μL CB0191S-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PDH（此步可选做）。
5.在步骤4的沉淀中加入 200μL CB0191S-B和 2μL CB0191S-C，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PDH 活性测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。
2.工作液配制：见产品组成表。工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中孵育 5min。
3.在1mL 玻璃比色皿中按顺序加入下列试剂：

四、PDH 活性计算：
1.按照样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 905×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性 (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T = 182.8×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性 (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.366×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细 胞总数，500 万。

1.测定过程中所有样本在冰上放置并于 2 小时内检测，以免变性和失活。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。