Mitochondrial Respiratory Chain ComplexV Activity Assay Kit (Microanalysis)

Name: Mitochondrial Respiratory Chain ComplexV Activity Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0096M
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0096M

别名 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒（微量法）

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

规格	价格	库存	数量
100 T	¥ 3,456	4-6日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi，通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

产品规格

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0096M-A	60mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0096M-B	50mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0096M-C	1 mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0096M-D	粉剂×1 支	-20℃保存；临用前加入1mL 蒸馏水，充分溶解备用，剩余试剂分装-20℃保存4周，避免反复冻融;
CB0096M-E	4mL×1 瓶	4℃保存；
CB0096M-F	粉剂×1 瓶	4℃保存；用前加入2mL蒸馏水充分混匀；4℃保存一周；
CB0096M-G	粉剂×1 瓶	4℃保存；用前加入5mL蒸馏水充分混匀；4℃保存一周；
CB0096M-H	粉剂×1 瓶	4℃保存；用前加入5mL蒸馏水充分混匀；4℃保存一周；
CB0096M-I	5mL×1 瓶	室温保存；
CB0096M-Standard	1mL×1 支	4℃保存（10 μmol/mL磷标液）；
标准磷应用液（0.5μmol/mL）配制：将 CB0096M-Standard用蒸馏水 20 倍稀释充分混匀即可
定磷试剂的配制：按 H₂O: CB0096M-G:H:I=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品测定的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL CB0096M-A和 10μL CB0096M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
5.步骤4中的沉淀即为线粒体，加入 800μL CB0096M-B和 8μL CB0096M-C，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

三、测定步骤：
1.酶促反应：在 EP管中加入下列试剂：

试剂名称	对照管（µL）	测定管（µL）
CB0096M-D	10	10
CB0096M-E	40	40
样本		50
混匀， 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 30min
CB0096M-F	20	20
样本	50
混匀，8000rpm，常温离心 10min，取上清液待测

2.定磷，在微量玻璃比色皿或96孔板中加入：

上清液	40	40
标准磷应用液			40
蒸馏水				40
定磷试剂	200	200	200	200
混匀，室温反应10min 左右，在 660nm 处分别记为 A对照管、A测定管、A标准管、A空白管，计算 ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。

四、复合体Ⅴ活性计算：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性 (U/mg prot) = ΔA测定÷ΔA标准×C 标准×V酶促×1000÷(Cpr×V样本)÷T =40×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2.按样本鲜重计算(检测样本数为 100T/24S)
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性 1 (U/g 质量) =ΔA1÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷(W÷V提取1×V样本)÷T =40×ΔA1÷ΔA标准÷W
复合体Ⅴ活性 2(U/g 质量)=ΔA2÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷(W÷V提取2×V样本)÷T =32×ΔA2÷ΔA标准÷W
复合体Ⅴ总活性(U/g 质量)=40×ΔA1÷ΔA标准÷W+32×ΔA2÷ΔA标准÷W
注：C 标准：标准溶液浓度，0.5μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V提取1：加入提取液体积，1.01mL；V提取2：沉淀重悬体积，0.808mL；T：反应时间，30min。

注意事项

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（＞1.2），可用蒸馏水稀释上清液后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数；若 ΔA 大于 0.4，需将样本稀释适当倍数，计算公式中乘以相应稀释倍数；若 ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
3.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之
和方为总酶活。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。