Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅡ Activity Assay Kit (Microanalysis)

Name: Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅡ Activity Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0116M
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0116M

别名 线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒（微量法）

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶 Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基 FAD 还原为 FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶 Q 生成还原型辅酶 Q，是呼吸电子传递链的支路。

规格	价格	库存	数量
100 T	¥ 4,082	10-12日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶 Q 可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通过检测 2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

产品规格

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0116M-A-ES-1	65mL×2 瓶	4℃保存；
CB0116M-A-ES-2	22mL×1 瓶	-20℃保存；
CB0116M-A	16mL×1 瓶	4℃保存；若试剂有析出，取上清溶液使用即可；
CB0116M-B	粉剂×1 支	-20℃保存；临用前加入0.1mL 丙酮（丙酮易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存 2 个月）：然后根据用量用丙酮 100 倍稀释后使用，现用现配；
CB0116M-C	粉剂×2 支	4℃保存；临用前取一支加入 1mL 丙酮溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周；
工作液配制：临用前根据用量将丙酮、CB0116M-B（稀释后）和CB0116M-C按 1:2:1比例混合，现用现配；
CB0116M-D	2.5mL×1 瓶	4℃保存；
CB0116M-E	1.5mL×1 瓶	4℃保存；

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500万细胞，加入 1mL 提取液1，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 10min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 15min，得到上清液和沉淀。
3.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。
4.步骤2中得到的沉淀即为线粒体，加入200μL提取液1和200μL提取液2，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 5s，间隔 10 秒，重复15 次），用于线粒体复合体Ⅱ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。
2.将CB0116M-A 于37℃预热15min。
3.样本测定，在微量玻璃比色皿/96孔板中按照下表操作：

试剂名称	测定管（µL）
样本	10
CB0116M-A	140
工作液	20
CB0116M-D	20
CB0116M-E	10
将上述试剂分别加入比色皿/96孔板后迅速吹打混匀，记录第10s的吸光值A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中准确反应5分钟（酶标仪有控温功能的将温度调节至37℃），之后迅速取出记录5min10s时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

四、线粒体复合体Ⅱ活力单位的计算
a.按微量比色皿计算：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 190.5×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
2.按样本鲜重计算(检测样本数为100T/48S)
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性1 (U/g质量) = [ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取÷V样本)÷T = 190.5×ΔA1÷W
复合体Ⅱ活性2(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V重悬×V样本))÷T=76.2×ΔA2÷W
复合体Ⅱ总活性(U/g 质量)=190.5×ΔA1÷W+76.2×ΔA2÷W
注：ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V提取：加入提取液1体积，1mL；V重悬：沉淀重悬体积，0.4 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
3.按细胞数量计算(检测样本数为100T/48S)
单位的定义：每10⁶个细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性1 (U/10⁶细胞) = [ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N÷V提取÷V样本)÷T = 190.5×ΔA1÷N
复合体Ⅱ活性2(U/10⁶细胞)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N÷V重悬×V样本))÷T=76.2×ΔA2÷N
复合体Ⅱ总活性(U/10⁶细胞)=190.5×ΔA1÷N+76.2×ΔA2÷N
注：ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V提取：加入提取液1体积，1mL；V重悬：沉淀重悬体积，0.4 mL；T：反应时间，5 min；N：细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
b.按96孔板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值大于 1.2（微量比色皿） /0.8 ( 96孔板），可用蒸馏水稀释上清液后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数；若ΔA大于0.6（微量比色皿） /0.4 ( 96孔板），需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
3.样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去重悬试剂（提取液1＋提取液2）本身的蛋自含量（约0.5mg/mL ）。
4.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。