LDH Cytotoxicity Assay Kit

500 T规格的产品组成如下：

1. 高灵敏度和高线性范围：适用于多种细胞系和不同毒性强度的处理条件。
2. 非放射性、无毒显色法：安全环保，适合常规实验室环境使用。
3. 兼容高通量筛选：可用于96孔或384孔板，适合自动化平台。
4. 可定量或相对比较：适用于药物筛选、杀伤细胞活性分析等多种实验需求。

1. 细胞毒性检测：用于评估药物、化合物或处理条件对细胞的毒性作用（细胞膜完整性损伤）。
2. 细胞凋亡与坏死分析：通过检测胞外 LDH 释放，反映细胞死亡过程中的膜通透性变化。
3. 免疫细胞杀伤实验：评价 NK 细胞、T 细胞等对靶细胞的杀伤活性（如 ADCC、CTL 实验）。
4. 肿瘤细胞代谢与损伤研究：作为肿瘤细胞增殖活性、坏死状态的间接指标，用于药效研究。

1. 预实验：LDH细胞毒性试验的细胞数优化
由于不同的细胞类型含有不同量的LDH，因此需要通过预实验确定最佳细胞数。
1)制备连续稀释的细胞液，吸取100 µL于96孔板，每种密度设置两组三个复孔。
注：a）A组用于最大LDH活性检测，B组用于自发LDH活性检测。b）最大细胞密度是根据预铺板结果而定，加入Lysis Solution之前最大细胞密度孔的细胞密度约为80-90%。
2)贴壁细胞需在37℃培养箱过夜培养，待细胞贴壁；悬浮细胞种板后即可进行检测。
3)向A组最大LDH活性稀释系列的三复孔中加入10 µL Lysis Solution，轻轻混合均匀。向B组自发LDH活性稀释系列的三复孔中加入10 µL培养基，轻轻混合均匀。
注：移液时不要产生气泡，因为气泡会影响准确的吸光度读数。
4)37℃培养箱孵育30 min。
5)将Substrate Solution和Dye Solution以100：1的比例混合，配制成Working Solution。例如取1 mL Substrate Solution与10 μL Dye Solution，混合均匀配成1.01 mL Working Solution，可用于20个孔的检测。
注：Working Solution不稳定，需要现配现用，配制和使用过程中均要注意避光。
6)将50 µL上清液转移到96孔平底酶标板上。
7)向每孔中加入50 µL Working Solution，轻轻混合均匀。室温下避光孵育20-40 min。
8)向每个样品孔加入50 µL Stop Solution，轻轻混合均匀。确保溶液中无气泡，立即检测490 nm和680 nm处的吸光度。从主波长测量值（490 nm）中减去背景吸光度（680 nm）。
9)绘制最大LDH活性吸光度值、自发LDH活性吸光度值与细胞数的关系图，以确定LDH细胞毒性测定的线性范围和最佳细胞数。对于目标细胞的浓度，其最大LDH活性吸光度值应小于2.0，且最大LDH活性吸光度值-自发LDH活性吸光度值应大于0.2。

2. 细胞毒性实验
1)组别设置

2)在96孔板中接种细胞悬液，100 μL/孔，三复孔，最佳细胞数由预实验确定。
3)贴壁细胞需在37℃培养箱过夜培养，待细胞贴壁；悬浮细胞种板后即可进行检测。
4)孵育过夜后，进行如下处理：向自发LDH活性一组三复孔细胞中加入10 μL培养基；向化合物处理LDH活性三复孔细胞中加入10 μL不同浓度的化合物；最大LDH活性不做处理。
5)37℃培养箱孵育适当时间。
6)向最大LDH活性对照的三重孔中加入10 µL Lysis Solution，轻轻混合均匀。
注：移液时不要产生气泡，因为气泡会影响准确的吸光度读数。
7)37℃培养箱孵育30 min。
8)将Substrate Solution和Dye Solution以100：1的比例混合，配制成Working Solution。例如取1 mL Substrate Solution与10 μL Dye Solution，混合均匀配成1.01 mL Working Solution，可用于20个孔的检测。
注：Working Solution不稳定，需要现配现用，配制和使用过程中均要注意避光。
9)每个样品取50 µL的上清液转移到96孔平底酶标板上，一式三孔。
10)向每孔中加入50 µL Working Solution，轻轻混合均匀。室温下避光孵育20-40 min。
11)向每个样品孔加入50 µL Stop Solution，轻轻混合均匀。确保溶液中无气泡，立即检测490 nm和680 nm处的吸光度。从主波长测量值（490 nm）中减去背景吸光度（680 nm）。
12)使用以下公式计算细胞毒性百分比
细胞毒性（%）=（A-B）/（C-B）*100%
A=化合物处理吸光度-培养基对照吸光度
B=自发LDH活性吸光度-培养基对照吸光度
C=最大LDH活性吸光度-最大LDH活性对照吸光度

-20℃保存一年。

1. 样品冷冻保存可能导致部分乳酸脱氢酶（LDH）失活，建议4℃短期保存（2–3天），样品尽量在当天检测完成。
2. 加入Working Solution后，反应时间越长，吸光值通常越高。不同细胞的LDH活性不一样，若信号值上升慢，可以适当增加孵育时间，但最好不要超过1 h，孵育时间过长，信号会出现下降的情况。
3. 在使用96孔板进行长时间培养时，应特别注意液体蒸发问题，最外圈孔不宜放置细胞。
4. 在用酶标仪读取前，应确保各孔内无气泡存在，否则可能会影响吸光度的准确性。
5. 建议使用多道移液器进行加样，以减少孔间误差，提高重复性和准确性。
6. 因血清中含有乳酸脱氢酶，推荐使用浓度不超过1%，并优选热灭活处理的血清。建议设置培养基对照孔（无细胞，仅加等量培养基）以校正背景信号。
7. 若细胞密度过高、生长时间过长，或离心力过大、培养环境温差显著等，均可能引发LDH释放增加，需在实验设计中加以控制。
8. 若需进行LDH活性绝对定量，用户需自备LDH标准品。
9. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
10. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• C0058-细胞毒性乳酸脱氢酶 (LDH) 检测试剂盒说明书-中文(1.34 MB)