Tannase Assay Kit (Microanalysis)

使用抗氧化剂没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，在270nn下测定底物PG反应前后的吸光度变化，计算单宁酶酶活力。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔（UV板）、研钵、冰、蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0209M-A体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0209M-A），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。10000rpm，4℃离心 10min，取上 清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到270 nm，蒸馏水调零。
2.将10μmol/mL的标准溶液用提取液稀释为0.05μmol/mL的标准溶液，测定其在270nm下的吸光度，记为A标准（标准管只需测定1-2次）。
3.吸取0.02mL样本于1.5mL EP管中作为对照管，沸水浴5min，冷却至常温。
4.操作表：

四、TAN活力单位的计算：
1.按照蛋白浓度计算
单位的定义：40℃下每毫克蛋白每分钟水解减少1nmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。
TAN活性(U/mg prot) =ΔA÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×Cpr)÷T=1000×ΔA÷A标准÷Cpr
2.按照样本鲜重计算
单位的定义：40℃下每克样品每分钟水解减少1nmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。
TAN活性(U/g 质量)= ΔA÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×W÷V提取)÷T=1000×ΔA÷A标准÷W
3.按细胞或细菌数量计算：
单位的定义：40℃下每10⁴个细胞或细菌每分钟水解减少1nmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。
TAN活性(U/10⁴ cell) = ΔA÷(A标准÷C标准)×1000×F×V酶促÷(V样本×500÷V提取)÷T=2×ΔA÷A标准。
C标准：标准溶液的浓度，0.05μmol/mL；F：上清液的稀释倍数，上述反应体系中 F=200μL÷10μL=20；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V样本：加入的样本体积，0.02mL；V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，10min。

1.可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃沸水浴处理。
2.务必使用96孔UV板（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光）。
3.如果A测定大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积0.2mL不变，如5μL上清液和195μL提取液（相当于 F=200/5=40），计算公式中需改变F和V上清液的数值。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。