AND Assay Kit (Microanalysis)

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

100T/48S规格的产品组成如下：

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、蒸馏水、无水乙醇和冰。
二、粗酶液提取：
1.除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入1 mL4℃预冷的CB0025M-A，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。
2.粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3.除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL CB0025M-A，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4.最终微粒体：向步骤3的沉淀中加CB0025M-B 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。
5.该待测液需当天使用。
三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2.CB0025M-B在37℃水浴中预热30min。
3.取EP管依次加入下列试剂：

四、AND活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性 (nmol/min/mg prot)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 45×(A测定管-A空白管)÷A标准管÷Cpr
2.按样本鲜重计算
活性单位定义：37℃中每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性 (nmol/min/g 鲜重)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W
注：C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：500μL=0.0005 L；稀释倍数：V反总÷V上清液= (50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用TargetMol生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒 (C0050)；V样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；V样总：提取液体积，0.5mL；T：催化反应时间（min），30min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性 (nmol/min/mg prot)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr
2.按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性 (nmol/min/g 鲜重)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T
= 45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W。
注：C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：500μL=0.0005 L；稀释倍数：V反总÷V上清液= (50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用TargetMol生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒 (C0050)；V样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；V样总：提取液体积，0.5 mL；T：催化反应时间（min），30min。

1.粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5mL 20%的甘油，分装后-80℃保存。
2.CB0025M-C和CB0025M-D需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用1周。
3.粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。