SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) 是一种 2× 浓度的即用型预混液，Mix 中含有热启动DNA Polymerase、SYBR Green I 荧光染料、dNTPs、Mg 2+。使用时，只需加入模板、引物、无菌超纯水便可进Real Time PCR 反应。操作简单方便，降低污染概率。
本品采用的DNA 聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA 聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR 扩增的因子和提升PCR 反应扩增效率的因子，使定量PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系, 对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。
本品不含有 ROX Reference Dye，适用于无需校正孔间荧光信号误差的仪器。适用机型如下：
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0;Lightcycler96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid:SmartCycler; Illumina:Eco qPCR.
| 组分 | 体积（μl） | 体积（μl） | 终浓度 |
|---|---|---|---|
| qPCR SYBR Green Master Mix (No ROX) | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
| Reverse Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
| 模板DNA | X | X | |
| 无菌超纯水 | to 50 | to 20 | |
| 总反应体系 | 50 | 20 |
【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。
b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1\/10。
c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
d) 反应体系：推荐使用20μl或50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95 °C | 5 min | 1 |
| 变性 | 95 °C | 10 sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60 °C | 30 sec ★ | 40 |
| 溶解曲线阶段 | 仪器默认设置 | 1 |
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95 °C | 5 min | 1 |
| 变性 | 95 °C | 10 sec | 40 |
| 退火 | 55-60 °C | 20 sec | 40 |
| 延伸 | 72 °C | 20 sec ★ | 40 |
| 溶解曲线阶段 | 仪器默认设置 | 1 |
【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus,7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31 sec以上：Applied Biosystems: 7300
34 sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
沪公网安备 31010602006700号
