1. 抗原样品制备
建议根据抗原样品的不同来源选择适当的预处理方式，以便将待检测抗原释放到样品溶液中。
1)血清样品：如果目标蛋白丰度较高，建议用Binding Buffer将血清样品稀释至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL，置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
2)悬浮细胞样品：在无菌条件下将PBS（10×）稀释为1×。离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1× PBS洗涤两次。然后按每毫克细胞5~10 µL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF 或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
3)贴壁细胞样品：吸去培养基，按每1.0×10^5个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次。用细胞刮刀收集细胞，置于1.5 mL EP管，按每1.0×10^5个细胞20~30 µL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上孵育10 min。离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
4)大肠杆菌样品：离心收集大肠杆菌（4℃, 12000 g, 2 min），弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤两次。然后按每克（湿重）菌体5~10 mL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min），置于冰上备用，或于-20℃长期保存。
5)组织样品：把组织剪切成细小的碎片，按照每20 mg组织150-250μL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂。用玻璃匀浆器冰上均质30-50次，或超声破碎细胞，每次30 s，3-4次，每次间隔1 min，置于冰上冷却。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。
注：以上方法制备的抗原样品适用于进行IP和Co-IP实验，如需进行ChIP实验，请另参照相关实验说明（如CST #9003）。

2. 磁珠预处理
1)将免疫沉淀磁珠用漩涡振荡器振荡1 min，使磁珠重新悬浮，取25~50 µL磁珠悬液放入1.5 mL EP管中。
2)加入200 µL Binding Buffer进行洗涤，将EP管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。
3)加入200 µL Binding Buffer重悬磁珠备用。

3. 抗体结合反应
1)抗体工作液的制备：将抗体样品用Binding Buffer稀释至终浓度为5~50 µg/mL，制备成抗体工作液，置于冰上备用。
2)抗体吸附：将步骤2中预处理的磁珠悬液进行磁性分离，吸去上清液。加入200 µL抗体工作液，迅速重悬磁珠，在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合15 min，然后进行磁性分离，收集上清液，置于冰上备用以供后续检测。
3)洗涤：向EP管中加入200 µL Binding Buffer进行洗涤，轻轻用移液器吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复上述洗涤步骤一次。

4. 抗体交联反应（可选操作）
如需同时洗脱抗体和目标抗原复合物，请跳过本步骤，直接进行步骤5。本步骤适用于需要单独洗脱目标抗原的实验，推荐使用BS3作为交联剂。具体实验操作请参照该试剂的说明书。

5. 抗原沉淀反应
1)抗原吸附：加入200 µL步骤1中制备的抗原样品，用移液器轻轻吹打，使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下使用翻转混合仪或手工轻轻翻转EP管混合10 min，以确保抗原与抗体充分结合。如结合力较弱，可在室温下孵育1 h，或在4℃下孵育过夜。
2)洗涤与转移：将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 µL Washing Buffer进行洗涤，用移液器轻轻吹打，使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。重复洗涤两次。最后，加入200 µL Washing Buffer，将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中，并进行磁性分离，吸去上清液，取下EP管。
注：抗原洗脱前，需将磁珠转移到新的EP管，以避免将管壁上非特异性吸附的蛋白一同洗脱。

6. 抗原洗脱
提供以下两种抗原洗脱方案，用户可根据后续检测的需要选择不同的洗脱方法。
1)变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向EP管中加入25 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer（自备），混合均匀，95℃加热5 min。然后进行磁性分离或者离心（室温，13000 g, 10 min），收集上清液，进行SDS-PAGE检测。
2)非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析。向EP管中加入20 µL Elution Buffer，混合均匀，室温孵育10 min。然后进行磁性分离或者离心（室温，13000 g, 10 min），收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 µL Neutralization Buffer，将洗脱产物pH调节至中性，用于后续功能分析。