Transhydrogenase-2 Assay Kit (UV Spectrophotometry)

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代 NAD⁺，TH-2 催化 APAD⁺ 还原生成 APADH，APADH 在 375nm 有特征光吸收，测定 375nm 光吸收的增加 速率，来计算 TH-2 活性。

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

二、样品的制备：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0177UV-A，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆液 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2（此步可选做）。
5.步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500μL CB0177UV-B，超声波破碎（冰浴，功率 20％ 或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-2 活性测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 375 nm，蒸馏水调零。
2.工作液的配制：临用前取CB0177UV-C、D、E各一支，将CB0177UV-D、E转移到CB0177UV-C中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；
3.在1mL 石英比色皿中按顺序加入下列试剂：

四、TH-2含量计算公式：
(1)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 82×ΔA÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 164×ΔA÷Cpr

(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性 (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T = 0.164×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，1.1×10^-3L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10³ L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；T： 反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞 总数，500 万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。