单胺类神经递质转运分子机制

在人类的大脑中，单胺神经递质执行着重要的信号传导功能，如运动、睡眠、奖励和情绪等。其中，囊泡单胺转运蛋白 ( VMAT ) 起到了关键的作用，这种蛋白位于突触小泡，负责单胺神经递质的转运，一旦 VMAT 发生突变便会导致单胺能神经回路的功能障碍，诱发各种神经退行性疾病和神经精神疾病，如抑郁症、帕金森病和舞蹈病等。

2023 年 11 月 1 日，美国圣裘德儿童研究医院李佳学、北京大学张哲共同通讯在 Nature 上发文 Mechanisms of neurotransmitter transport and drug inhibition in human VMAT2 ，揭示了 VMAT 的底物转运机制和药物抑制的分子机制，为理解突触囊泡转运蛋白包装神经递质的生理学和药理学性质提供了理论框架。

单胺是一类重要的神经递质，主要包含多巴胺 ( dopamine，DA ) 、血清素（又名 5- 羟色胺，serotonin，5-HT）、去甲肾上腺素 ( noradrenaline, NE ) 和肾上腺素 ( adrenaline, E ) 等。单胺能神经元回路在运动、睡眠、奖励、情绪等生理和认知功能的调节中发挥着重要作用。这些神经递质在突触前神经元合成，并由囊泡单胺转运蛋白 ( VMAT ) 包装运输到突触小泡中。

在小鼠和人类当中，VMAT 转运蛋白的缺失或缺陷可能导致死亡率增加、发育迟缓、肌张力障碍和帕金森症等疾病。因此，VMAT 作为重要的治疗靶点，在高血压、精神病性躁动、精神兴奋剂滥用、亨廷顿舞蹈病以及其他多动性运动障碍的药物开发中起到了关键的作用。然而，这些转运蛋白的底物转运以及药物抑制机制仍然未知。

小贴士

VMAT 属于主要促进子超家族 ( MFS ) 内的 SLC18 转运蛋白家族，是一种质子耦合反向转运蛋白，利用囊泡质子梯度的能量来驱动单胺的易位。由于其广泛的底物特异性， VMAT 可以将不同的单胺神经递质转运到突触小泡中。在哺乳动物中已鉴定出两个 VMAT 蛋白家族成员： VMAT1 ( SLC18A1 ) 和 VMAT2 ( SLC18A2 ) 。

VMAT1 主要在外周内分泌细胞中表达， VMAT2 则表达更为广泛，并且作为负责神经元单胺转运的主要蛋白，在神经生理学中起到关键的作用。目前已有两种靶向 VMAT2 的抑制剂丁苯那嗪 ( Tetrabenazine，TBZ ) 和利血平 ( Reserpine ) 分别用于亨廷顿舞蹈病和高血压的治疗。但这两种药物对 VMAT2 的抑制原理并不相同（非竞争性抑制剂/竞争性抑制剂）。

由于人 VMAT2 蛋白尺寸小 ( ~56kDa ) 且大部分嵌入脂质双层膜中，缺乏刚性可溶域，使得冷冻电镜的拍摄和结构测定比较困难。本研究采用了一种融合蛋白策略有效的扩大了蛋白颗粒尺寸，从而首次成功拍摄到了目标蛋白与抑制药物复合物的结构。

研究使用螺旋接头将麦芽糖结合蛋白 ( MBP ) 标签附加到 VMAT2 的 N 末端，并在 C 末端连接一个经过设计的特异性识别 MBP 标签的锚蛋白重复折叠蛋白（DARPin），得到修饰后的转运蛋白 VMAT2 EM 。

VMAT2 EM 在 HEK293 细胞中的多巴胺转运能力与未修饰的 VMAT2 相当，且同样对 TBZ 和利血平敏感。在冷冻电镜下分别以 2.9 Å 和 3.2 Å 的分辨率拍摄到 VMAT2 EM 与 TBZ 和利血平结合的结构。

▲ VMAT2 与治疗药物复合物的冷冻电镜结构

VMAT2 是由 12 个跨膜螺旋 ( TM ) 组成的典型 MFS 折叠转运蛋白，具有两个结构相似的结构域， N 结构域 ( TM1-TM6 ) 和 C 结构域 ( TM7-TM12 ) 。其间的中心空腔是通常情况下底物的结合位点，靶向 VMAT2 的抑制剂通过改变 N 结构域和 C 结构域向外（细胞质）或向内（囊泡腔）的构象来抑制其与底物的结合与转运。

VMAT2 与 TBZ 结合

VMAT2 EM - TBZ 复合物的冷冻电镜结构显示，TBZ 位于由 TM1 和 TM4 （N域）以及 TM7 和 TM10 （ C 域）形成的中央空腔中，并且诱导转运蛋白向内腔的闭塞构象，将 VMAT2 锁定在对膜两侧都封闭的中间状态，抑制其底物转运功能。

▲TBZ的抑制机制

VMAT2 与利血平结合

由于利血平与 VMAT2 的结合需要跨膜质子梯度，作者在 VMAT2 EM 中引入了替换，使用 VMAT2 EM Y418S 突变体与利血平结合，模拟在细胞中的真实结合状态。与 VMAT2 EM - TBZ 复合物面向内腔的闭塞构象相反，利血平结合的 VMAT2 构象面向细胞质开放，这是一种准备从细胞质中摄取单胺神经递质的状态。

利血平位于中央空腔，长轴夹在 N-结构域和 C-结构域之间，并与跨膜螺旋平行排列。与 TBZ 的结合机制不同，这种结合通过阻断易位途径，防止胞质中的单胺进入转运蛋白，与底物形成直接竞争关系。

▲利血平的抑制机制

VMAT2 结合并转运血清素

为了进一步了解药物的作用机制以及神经递质运输的过程，作者在 3.7 Å 分辨率下拍摄到 VMAT2 EM Y418S 的血清素 ( 5-HT ) 结合结构。该结构显示 5-HT 结合的 VMAT2 采用面向细胞质的开放构象 ，吲哚环通过与 V232 和 I308 的疏水相互作用而稳定，氨基与 E312 的侧链羧酸酯基团形成盐桥。该结合位点 与利血平吲哚基团的位点重叠 ，因此解释了利血平阻碍 VMAT2 与血清素的结合与转运的竞争机制。

▲血清素结合和识别

在比较了 VMAT2 面向细胞质和面向囊泡内的构象后，作者提出，VMAT2 的 N 结构域和 C 结构域通过模拟摇杆开关的运动方式实现底物的转运。在面向细胞质的状态下， VMAT2 的细胞质区域开放，允许底物进入。底物的结合触发细胞质门的关闭，这一过程主要由 TM4 、 TM5 、 TM10 和 TM11 上的两层蛋氨酸和酪氨酸残基之间的相互作用形成。

在底物易位的过程中， VMAT2 会发生构象改变， W318 摆动，打开由 TM1 的 V41 和 P45 以及 TM7 的 E312 、P313 和 P316 组成的面向囊泡腔的门，将底物释放到囊泡腔中。在底物释放后， VMAT2 与囊泡腔中的质子结合，使转运蛋白返回其面向细胞质的构象，进行下一次底物转运。

▲底物易位机制

总结

综上，本研究通过冷冻电镜探究了 VMAT2 与 TBZ 、利血平以及血清素的结合位点，阐明了非竞争性以及竞争性抑制剂不同的作用原理，并提出 VMAT2 的底物转运机制。建立了单胺神经递质在囊泡膜上包装和运输过程的分子机制框架，促进了靶向 VMAT2 的药物开发，让我们一起期待后续的药物研发进展吧~

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◆Tetrabenazine

Tetrabenazine 是 VMAT 抑制剂，用作抗精神病药和治疗各种运动障碍。

◆Reserpine

Reserpine 是一种从催吐萝芙木的根中发现的生物碱。它抑制去甲肾上腺素吸收到储存囊泡中，导致中枢和外周轴突末端的儿茶酚胺和血清素耗尽。它可作为抗高血压药和抗精神病药以及研究工具。

◆Serotonin

Serotonin 是 CNS 中的单胺神经递质和内源性 5-HT 受体激动剂。它也是儿茶酚 O-甲基转移酶 ( COMT ) 的抑制剂，Ki 值为 44 μM。

好了，今天的 T 仔号文献列车即将到站。希望大家科研顺利哦，我们下次再见~

参考文献：

[1] Pidathala S, Liao S, Dai Y, et al. Mechanisms of neurotransmitter transport and drug inhibition in human VMAT2 [published online ahead of print, 2023 Nov 1]. Nature. 2023;10.1038/s41586-023-06727-9. doi:10.1038/s41586-023-06727-9

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VMAT2 与 TBZ 结合

VMAT2 与利血平结合

VMAT2 结合并转运血清素