脂肪肝

PNAS：发现脂肪肝治疗新靶点！

说到脂肪肝（Fatty liver disease, FLD），大家一定不陌生，每年体检，被查出脂肪肝的大有人在，但由于脂肪肝初期并没有明显的症状，很多人对此并不重视，还是该吃吃该喝喝，等到进展成肝炎、肝癌了才追悔莫及。

脂肪肝是由于多种原因引起的肝脏细胞内脂肪堆积过多（主要是由甘油三酯，TG）而产生的常见肝脏病变，已成为全球肝损伤的主要原因。

脂肪肝进展到晚期可导致肝硬化和肝细胞癌，对公共健康造成重大威胁，目前还没有药物被批准用于治疗 FLD，因此，迫切需要开发新的药物靶点和有效疗法。

2024年1月31日，一篇发表在 PNAS 题为 The ubiquitin E3 ligase BFAR promotes degradation of PNPLA3 的研究论文引起广泛关注，该文研究团队发现泛素 E3 连接酶 BFAR ，可以促进 FLD 的重要遗传危险因素 PNPLA3 的降解，为 FLD 治疗提供了新靶点。

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实验中，研究团队首先鉴定并确认了细胞凋亡调节因子 BFAR 作为 PNPLA3 的 E3 泛素连接酶，可以发挥对 PNPLA3 的调节作用。

而后，使用 siRNA 敲除了稳定表达 PNPLA3 的 HuH7 细胞中的 BFAR，发现处理后细胞 PNPLA3 蛋白水平提高了 2.8 倍。通过解析 BFAR 的重组形式，并使用 CRISPR-Cas9 技术生成 BFAR 表达失活的细胞系，通过 Sanger 测序确认失活突变。

结果表明，在 BFAR 失活的细胞中，PNPLA3-HiBiT（用于检测和追踪PNPLA3水平的融合蛋白）的水平增加了 5 倍至 20 倍，说明 BFAR 的耗竭可以增加培养的肝细胞中的 PNPLA3 水平。

▲肝细胞中 BFAR 的结构域组织、结构模型和BFAR失活

进一步的验证实验也显示，BFAR 的过表达可以降低培养肝细胞中 PNPLA3 蛋白水平。此外，通过使用重组 PNPLA3 和 BFAR 进行的下拉试验，显示这两种蛋白之间存在相互作用，并在细胞中观察到它们的免疫共沉淀作用。

为了测试 BFAR 是否可以泛素化 PNPLA3，研究团队使用重组蛋白进行了体外测定证实和细胞实验验证，体外测定发现 BFAR 可以作为 E3 泛素连接酶用于 PNPLA3 的单泛素化；细胞实验中敲除 BFAR 不会导致 PNPLA3 泛素化减少，但细胞中 PNPLA3 有增加的趋势。

▲BFAR 对 PNPLA3 的泛素化

研究人员还通过 CRISPR-Cas9 技术构建了 Bfar⁻^/⁻鼠，与 WT 小鼠进行免疫印迹对照实验，发现 Bfar⁻^/⁻小鼠肝脏中 PNPLA3 水平高出 WT 小鼠 2 倍。然而，尽管高水平的 PNPLA3 蛋白在脂滴上的积累与肝脏 TG 的增加相关，但在 Bfar 基因敲除小鼠中未观察到肝脏 TG 的增加。这表明 PNPLA3 的积累可能与肝脏 TG 水平的变化有关，但具体机制仍需进一步研究。

同时，研究还发现肝脏 BFAR 水平不会因小鼠食物摄入量而变化。

在 WT 小鼠中，蔗糖喂养可增加 PNPLA3 mRNA 和蛋白的水平。为了确定 BFAR 表达是否也受到喂养的调节，团队测量了禁食小鼠肝脏中 BFAR 蛋白和 mRNA 的水平，发现在禁食和喂食小鼠肝脏中 BFAR 蛋白水平无差异。

小结

综上，这项研究发现，PNPLA3的突变形式在脂滴上积累，干扰肝脏三酰甘油的积累，从而促使脂肪肝病的发展。BFAR作为一个E3泛素连接酶，通过促进PNPLA3的降解来调节其水平。实验结果表明，BFAR的失活导致PNPLA3水平增加，而BFAR的过表达则降低PNPLA3水平。这些发现揭示了BFAR在调控肝细胞中PNPLA3水平的作用机制，为治疗FLD的研究提供了新思路。

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参考资料：

[1] Das A, Cheng H, Wang Y, Kinch LN, Liang G, Hong S, Hobbs HH, Cohen JC. The ubiquitin E3 ligase BFAR promotes degradation of PNPLA3. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Feb 6;121(6):e2312291121. doi: 10.1073/pnas.2312291121. Epub 2024 Jan 31. PMID: 38294943; PMCID: PMC10861911.