5-FAM (5-Carboxyfluorescein) (5-Carboxyfluorescein) contains a carboxylic acid, which can be used to react with primary amines via carbodiimide activation of the carboxylic acid. Fluorescein is the most common fluorescent derivatization reagent for labeling biomolecules. In addition to its excellent fluorescence quantum yield, relatively high absorptivity, and good water solubility, it also has an excitation maximum that closely matches the 488 nm spectral line of the argon-ion laser.

使用方法
1. 配制与储存
a. 溶解性：5-FAM 通常以粉末形式提供，易溶于 DMSO、DMF、或 pH ≥ 8 的水溶液。
b. 推荐储备液浓度： 10–100 mM（根据实验需要调整）。使用前，建议用无水溶剂配制并分装小体积，避免反复冻融。
2. 生物分子标记（如蛋白质、核酸）
a. 活化反应：
通常将 5-FAM 与活化试剂（如 EDC/NHS）结合，生成活性酯，以便于与目标分子的胺基反应。
b. 反应缓冲液推荐使用无胺的中性缓冲液（如 MES 或 PBS，pH 6–8）。
c. 结合步骤：将活性酯与目标分子混合，室温反应 1–2 小时，必要时优化 pH 和反应时间。
d. 纯化：使用透析或凝胶过滤法去除未反应的 5-FAM。
3. 荧光成像
a. 样本准备：稀释 5-FAM 到工作浓度（通常为 1–10 µM）。
b. 对细胞或组织直接涂布或孵育 10–30 分钟，随后用 PBS 洗涤去除未结合染料。
c. 显微镜观察：激发波长： ~495 nm。发射波长： ~520 nm（绿色荧光）。