1. 特异性强，背景信号少。
2. 适用性广，能用于多种样本类型。
3. 细胞毒性低。
4. 荧光信号稳定
5. 操作简便。

凋亡早期线粒体膜电位检测、线粒体靶向药物开发、线粒体功能与代谢疾病研究、衰老细胞线粒体功能衰退研究。

用适宜稀释液（无血清培养基或PBS）将储备液稀释成浓度为1-20 μM的工作液。
本试剂盒若用于6孔板，工作液浓度为20 μM，每孔检测体积为1 mL，则可检测100次；若用于96孔板，工作液浓度为20 μM，每孔检测体积为100μL，则可检测1000次。

1. 对照组设置：
   （1）阳性对照组（CCCP组）：CCCP是一种常用的解偶联剂，其作为质子载体可携带质子穿过线粒体内膜，消除膜两侧的质子浓度差，线粒体膜电位依赖于质子梯度的维持，CCCP的作用会导致线粒体膜电位迅速下降。CCCP能诱导线粒体膜电位丧失，在线粒体膜电位检测实验中常被用作阳性对照。
   具体步骤为：用无血清培养基将CCCP储备液（10 mM）稀释成浓度为10 µM的CCCP工作液。吸除旧培养基，向细胞加入CCCP工作液，处理20-30 min。然后按下述对悬浮细胞或贴壁细胞进行TMRE染色的步骤，加入适量TMRE工作液，进行线粒体膜电位检测。10 µM CCCP处理20-30 min几乎能诱导大多数细胞的线粒体膜电位丧失，经TMRE染色后观察到弱红色荧光或几乎无荧光；线粒体膜电位正常的细胞经TMRE染色后可观察到明亮的红色荧光。
   （2）阴性对照组（溶剂对照组）：不进行药物处理或其他干预，排除药物本身或实验操作导致的非特异性荧光干扰。
   （3）空白对照组：细胞不用药物处理，也不经TMRE染色，用于检测自发荧光或背景信号。
2. 悬浮细胞线粒体膜电位检测：
   （1） 将细胞悬液以600×g室温离心5 min，弃上清。加入37℃预热的PBS重悬细胞，以600×g室温离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀。
   （2） 加入适量TMRE染色工作液重悬细胞，调整细胞密度为5×10^5-1×10^6 cells/mL，将细胞转移至37℃细胞培养箱避光孵育15-50 min。
   （3） 孵育结束后，以600×g室温离心5 min，弃上清。
   （4） 加入37℃预热的PBS重悬细胞，600×g室温离心5 min，弃上清。重复洗涤1次。
   （5） 加入适量37℃预热的细胞培养基重悬细胞，然后在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察染色情况，也可用流式细胞仪或荧光分光光度计检测染色结果。Ex=550 nm，Em=575 nm左右。测定荧光时无需将激发光与发射光波长严格限定在最大波长处，可参考其他红色荧光探针（如Rhodamine）的激发光/发射光波长设置。
3. 贴壁细胞线粒体膜电位检测：
   （1） 将细胞接种在无菌爬片上培养，待培养完成后吸除培养液，用37℃预热的PBS洗涤细胞一次。
   （2） 加入适量TMRE染色工作液，将细胞转移至37℃细胞培养箱15-50 min。
   （3） 吸除染色液，用37℃预热的PBS洗涤细胞2次。
   （4） 加入37℃预热的细胞培养基覆盖住细胞，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察染色结果。Ex=550 nm，Em=575 nm左右。测定荧光时无需将激发光与发射光波长严格限定在最大波长处，可参考其他红色荧光探针（如Rhodamine）的激发光/发射光波长设置。
   注：若需要用流式细胞仪或荧光分光光度计检测贴壁细胞，可先用胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化，收集、重悬细胞后参照上述悬浮细胞的操作步骤进行线粒体膜电位检测。

-20℃避光储存，一年有效。

1. 由于样本类型和实验环境的不同均会影响染色效率，建议通过预实验来优化TMRE工作液浓度和染色时间。
2. CCCP的最佳工作浓度和处理时间也可能因为样本不同而有差异，可通过预实验调整最佳条件，建议工作浓度范围是1-20 µM。
3. TMRE荧光探针适用于活细胞的线粒体膜电位检测，而不适用于固定细胞线或固定组织的线粒体膜电位检测。
4. TMRE属于荧光染料，光照易导致荧光淬灭，操作过程应注意避光。
5. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
6. 为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。

• C0175-线粒体膜电位检测试剂盒 (TMRE)说明书-中文(1.30 MB)