1. 灵敏度高。
2. 对照体系完善。
3. 细胞毒性低。
4. 探针稳定性好。
5. 适用性广，能用于多种样本类型。

凋亡早期线粒体膜电位检测、线粒体靶向药物开发、线粒体功能与代谢疾病研究、衰老细胞线粒体功能衰退研究。

用适宜稀释液（无血清培养基或PBS）将储备液稀释成浓度为1-20 μM的工作液。
本试剂盒若用于6孔板，工作液浓度为20 μM，每孔检测体积为1 mL，则可检测100次；若用于96孔板，工作液浓度为20 μM，每孔检测体积为100μL，则可检测1000次。

1. 对照组设置：
   （1）阳性对照组（CCCP组）：CCCP是一种常用的解偶联剂，其作为质子载体可携带质子穿过线粒体内膜，消除膜两侧的质子浓度差，线粒体膜电位依赖于质子梯度的维持，CCCP的作用会导致线粒体膜电位迅速下降。CCCP能诱导线粒体膜电位丧失，在线粒体膜电位检测实验中常被用作阳性对照。
   具体步骤为：用无血清培养基将CCCP储备液（10 mM）稀释成浓度为10 µM的CCCP工作液。吸除旧培养基，向细胞加入CCCP工作液，处理20-30 min。然后按下述对悬浮细胞或贴壁细胞进行Rhodamine 123染色的步骤，加入适量Rhodamine 123工作液，进行线粒体膜电位检测。10 µM CCCP处理20-30 min几乎能诱导大多数细胞的线粒体膜电位丧失，经Rhodamine 123染色后观察到微弱绿色荧光或几乎无荧光；线粒体膜电位正常的细胞经Rhodamine 123染色后可观察到明亮的绿色荧光。
   （2）阴性对照组（溶剂对照组）：细胞不进行药物处理或其他干预，进行Rhodamine 123染色，排除药物本身或实验操作导致的非特异性荧光干扰。
   （3）空白对照组：细胞不用药物处理，也不经Rhodamine 123染色，用于检测自发荧光或背景信号。
2. 对于悬浮细胞：
   （1）将细胞悬液以600×g室温离心5 min，弃上清。加入37℃预热的PBS重悬细胞，以600×g室温离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀。
   （2）加入适量Rhodamine 123染色工作液重悬细胞，调整细胞密度为5×10^5-1×10^6 cells/mL，将细胞转移至37℃细胞培养箱中避光孵育20-60 min。
   （3）孵育结束后，以600×g、室温离心5 min，弃上清。
   （4）加入37℃预热的PBS重悬细胞，以600×g、室温离心5 min，弃上清。重复此步骤1次。
   （5）加入适量37℃预热的细胞培养基重悬细胞，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察染色情况，也可以用流式细胞仪或荧光分光光度计检测染色结果。Ex=507 nm，Em=529 nm左右。
3. 对于贴壁细胞：
   （1）吸除培养液，加入37℃预热的PBS洗涤细胞1次。
   （2）加入适量Rhodamine 123染色工作液，将细胞转移至37℃细胞培养箱中避光孵育20-60 min。
   （3）孵育结束后，吸除染色液，用37℃预热的PBS洗涤细胞2次。
   （4）加入37℃预热的细胞培养基覆盖住细胞，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。Ex=507 nm，Em=529 nm左右。
   注：若需要用流式细胞仪或荧光分光光度计检测贴壁细胞，可先用胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化，收集、重悬细胞后参照上述悬浮细胞的操作步骤进行线粒体膜电位检测。

-20ºC避光保存，一年有效。

1. 由于样本类型和实验环境的不同均会影响染色效率，建议通过预实验来优化Rhodamine 123工作液浓度和染色时间。
2. CCCP的最佳工作浓度和处理时间也可能因为样本不同而有差异，可通过预实验调整最佳条件，建议工作浓度范围是1-20 µM。
3. Rhodamine 123荧光探针适用于活细胞的线粒体膜电位检测，而不适用于固定细胞或固定组织的线粒体膜电位检测。
4. Rhodamine 123属于荧光染料，光照易导致荧光淬灭，操作过程应注意避光，染色工作液建议现配现用。
5. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
6. 为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。

• C0176-线粒体膜电位检测试剂盒 (Rhodamine 123)说明书-中文(1.30 MB)