Trehalase Assay Kit (Microanalysis)

采用 3.5-二硝基水杨酸法测定 THL 催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与 3.5-二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断 THL 活性的高低。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、低温离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、海藻糖提取：
1.细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0131M-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0131M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织的处理：按照组织质量（g）：CB0131M-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织，加入 1mL CB0131M-ES），冰浴匀浆；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）的处理：吸取约0.1mL血清（浆），加入0.9mL CB0131M-ES，冰浴匀浆；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零。
2.将10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释至 2、1.5、1、0.5、0.25mg/mL，现用现配。
3.加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

四、酶活性计算公式：
a. 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/mg prot) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 9.26×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/g 鲜重) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T = 9.26×△A÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/10⁴ cell) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T = 9.26×△A÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/L) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T = 9260×△A
注：ε：ABTS毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.3mL；V样：反应体系中样本体积，0.045mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/mg prot) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 18.52×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/g 鲜重) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T = 18.52×△A÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/10⁴ cell) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T = 18.52×△A÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性 (U/L) = ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T = 18520×△A
注：ε：ABTS毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.3mL；V样：反应中样本体积，0.045mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.极少数样本在60℃水浴20min后会出现沉淀，可经过8000g 25℃离心10min后，取上清检测，例如成熟的水稻叶片样本。
3.为确保检测准确性，若ΔA大于2，将样本用提取液稀释2~10倍后重新检测，计算公式乘以相应稀释倍数。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。