G6PDH Assay Kit (UV Spectrophotometry)

G6PDH催化NADP⁺还原生成NADPH，在340 nm下测定NADPH增加速率。

50T/48S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.细菌、细胞或组织样品的制备：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0222UV-ES体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL CB0222UV-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0222UV-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0222UV-ES），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）等液体样品：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.工作液：将CB0222UV-B和CB0222UV-C转移至CB0222UV-A中充分溶解；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.样本测定（按下表在1mL石英比色皿中加入如下试剂）：

四、G6PDH活力单位的计算：
1.血清(浆)G6PDH活力的计算：
单位的定义：每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 643×ΔA
2.组织、细菌或细胞中G6PDH活力的计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T = 0.3215×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入CB0222UV-ES体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万；10⁹：单位换算系数，1mol =10⁹nmol。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。
3.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中，在
反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
5.若样本测定初始值（0s）大于 0.5 而 ΔA测定小于 0.1，可将样本稀释后再行测定。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。